專利名稱：利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因重組的方法，特別是涉及一種利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法。
背景技術：
克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)是一株革蘭氏陰性細菌,是克雷伯氏菌屬的模式種，屬于腸桿菌科。克雷伯氏肺炎桿菌具有生長速度快、可以利用多種碳源和代謝產物豐富等特點，目前主要作為2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化學品的生產用菌，同時克雷伯氏肺炎桿菌可以代謝合成3-羥基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氫氣等化學品，克雷伯氏肺炎桿菌還可以作為宿主細胞構建3-羥基丙酸等化合物生產菌，使得克雷伯 氏肺炎桿菌成為一種具有廣闊工業化應用前景的微生物。由于克雷伯氏肺炎桿菌特殊的細胞結構和遺傳背景，適應于克雷伯氏肺炎桿菌的遺傳改造方法操作比較復雜。目前，對克雷伯肺炎桿菌進行基因改造的主要方法有轉座子插入突變和同源重組敲除目的基因，而同源重組方法主要涉及到用自殺性質粒和用線性的DNA進行重組。轉座子插入突變是利用轉座子隨機的插入染色體上，使被插入的基因失活。常見的轉座子有Tn5、TnlO、Tn916、Tn917等。Chang HY等利用Tn5在克雷伯氏肺炎桿菌CG43的染色體上插入失活得到莢膜缺失的菌株[Chang HY, et al. , Virulence and outermembrane properties of a galUmutant of Klebsiella pneumoniae CG43. Microbial pathogenesis，1996，20 (5) :P. 255-261]。自殺性質粒的方法是通過向克雷伯氏菌中引入自殺性質粒，使處于質粒上的序列與染色體上的同源序列發生重組，從而實現基因的替換。利用該方法Yang等通過構建自殺質粒轉進E. coli SMlO中，然后與產酸克雷伯氏菌M5al接合，進而敲出了產酸克雷伯氏菌 M5al 乳酸脫氣酶基因(IdhA) [Yang G, et al. , Fermentation of I, 3propanediol by alactate deficient mutant of Klebsiella oxytoca under microaerobic conditions.Applied microbiology and biotechnology，2007，73 (5) :P. 1017-1024]。Xu 等通過自殺質粒敲除了克雷伯氏肺炎桿菌HR526的乳酸脫氫酶基因[Xu Y.Z.，et al. , Metabolismin 1，3-propanediol fed—batch fermentation by a D-Iactate deficient mutantof Klebsiella pneumoniae. Biotechnology and bioengineering, 2009，104(5):P.965-972]。另外，Horng等利用自殺質粒通過同源重組成功將克雷伯氏肺炎桿菌合成1，3-丙二醇途徑 dhaD 和 dhaK 兩個基因進行了 失活[Horng, Y. T.，et al.，Inactivationof dhaD and dhaK abolishes by-product accumulation duringl，3-propanediolproduction in Klebsiella pneumoniae. Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology,2010. 37:P. 1-10]0線性DNA重組是利用電擊轉化的方法將線性DNA轉入克雷伯氏肺炎桿菌，使得位于線性DNA上的同源序列與染色體上的目的序列發生重組，實現重組替換。Seo等將抗性標記兩端帶有500bp的同源臂的線性DNA片段轉入到克雷伯氏肺炎桿菌Cu中，利用細胞本身具有的重組功能，成功將菌株的甘油脫氫酶基因和1，3-丙二醇氧化還原酶基因進行了敲除[Seo, M. Y. , et al. , Elimination of by-product formation during production ofI, 3-propanediol in Klebsiella pneumoniae by inactivation of glycerol oxidativepathway. Applied microbiology and biotechnology, 2009. 84 (3) :P. 527-534]。郝健等發明了一種利用Red重組酶輔助的用于克雷伯氏肺炎桿菌的基因重組方法，在大腸桿菌中利用攜帶短同源臂的線性DNA與質粒進行重組制備·具有長同源臂的線性DNA，將長同源臂的DNA轉入克雷伯氏肺炎桿菌，利用質粒pDK6-red表達Red重組酶的，成功的將克雷伯肺炎桿菌中編碼二羥基丙酮激酶的基因進行了敲除[郝健等，克雷伯氏肺炎桿菌的基因重組方法，中國專利申請號 201110435825 ;Wei D. , et al. , Red recombinase assisted genereplacement in klebsiella pneumoniae. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012. 39:P. 1219-1226]。但對于克雷伯氏肺炎桿菌基因重組，已有的技術都采用較長的同源臂，需要將目的基因克隆出來用于構建長同源臂，需要更加簡單、方便的方法，促進研究。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法。該方法不需要克隆目的基因，同源臂直接設計在PCR引物上，簡單、快捷，且能進行多次基因操作，具有廣泛的應用前景。為解決上述技術問題，本發明的利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，包括以下步驟I) PCR擴增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重組基因的同源序列，具體如下以攜帶第一抗性基因(抗性標記)的質粒為模板，進行PCR擴增，獲得第一抗性基因片段；其中，PCR擴增引物的5’端設計成與需要進行重組的基因序列同源的序列，同源序列長度在39-50堿基范圍，PCR擴增引物的3’端設計成與需要擴增的抗性基因兩側同源的序列，使擴增獲得的線性DNA中間為第一抗性基因，第一抗性基因的兩側連接有用于進行基因重組的短的同源序列；所述擴增抗性基因的引物設計方法以及攜帶抗性基因的質粒特征見[Gust
B., et al. , PCR-targeting system in streptomyces coelicolor A3(2). John InnesCentre:Norwich, 2002]詳細描述。2)將擴增的第一抗性基因片段與克隆質粒連接后，將連接產物轉化至大腸桿菌中，經篩選，得到陽性克隆質粒；3) PCR制備用于基因重組的DNA片段以步驟2)的克隆質粒上的克隆位點上下游序列作為保護序列，設計PCR擴增引物，并以步驟2)得到的陽性克隆質粒為模板，進行PCR擴增，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段；本步驟中，通過設計引物、PCR擴增包含抗性基因、短同源臂以及相鄰的上下游序列；
其中，該同源重組DNA片段(線性DNA片段)中間為第一抗性基因，第一抗性基因兩側是短同源臂，短同源臂兩側是來源于克隆質粒上的序列，即第一抗性基因的兩側連接有用于基因敲除的短同源臂，短同源臂外側連接有來自克隆質粒的序列作為保護序列；該短同源臂由步驟I)中的設計于引物上的短的同源序列形成。4)將步驟3)獲得的同源重組DNA片段，電擊轉化至含有pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞內；5)將步驟4)的轉化后的克雷伯氏肺炎桿菌細胞進行培養，篩選獲得陽性重組子，從而獲得基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細胞。所述利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，還可包括6)步驟5)獲得的基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細胞(重組子)，通過利用攜帶第N抗性基因的質粒，可以重新按照步驟I) 5)進行操作，制備同時攜帶第N抗性基因(其他抗性標記)的同源重組DNA片段，以進行第二次或多于兩次的基因重組操作。其中，攜帶第·N抗性基因的質粒中，N是大于或等于2的整數，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；該攜帶第N抗性基因的質粒包括攜帶氯霉素抗性的質粒、攜帶四環素抗性的質粒、攜帶鏈霉素抗性的質粒或攜帶安普霉素抗性的質粒；即第N抗性基因包括氯霉素抗性基因、四環素抗性基因、鏈霉素抗性基因或安普霉素抗性基因。另外，本發明利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法中，當需要重組后將抗性基因消除時，可在步驟I)中加入如下步驟在抗性基因(抗性標記)的兩端添加 FRT 序列 gaagttcctatactttcta gagaataggaacttc (如 SEQ ID NO. I 所不)。所述步驟I)中，攜帶第一抗性基因的質粒包括攜帶安譜霉素抗性的質粒(如攜帶安譜霉素抗性的PU773質粒)，攜帶鏈霉素(壯觀霉素)抗性的質粒，攜帶四環素抗性的質粒，或攜帶氯霉素抗性的質粒。步驟I)中，短的同源序列是指可以設計在PCR引物上的、與需要進行重組的目的基因同源的序列，長度在39到50堿基。所述步驟3)中，保護序列可以是任意的DNA序列，如長度為200-2000堿基對的保護序列，其中優選長度為400-700堿基對的保護序列。所述步驟5)中的陽性重組子，能通過卡那霉素篩選質粒pDK6-red丟失的克雷伯氏肺炎桿菌的菌株，然后，轉進pDK6-flp質粒來消除插入染色體的兩端連接有FRT序列的抗性基因，獲得消除抗性標記的菌株。其中，該消除抗性標記的菌株，再通過卡那霉素篩選丟失質粒pDK6-flp的菌株后,再轉進質粒pDK6-red后,可以按照上述步驟1)_6)重新進行基因同源重組操作。上述pDK6_red質粒和pDK6_flp質粒是攜帶卡那霉素抗性基因的質粒，受乳糖操縱子調控，分別表達Red重組酶和Flp重組酶，見[Wei D. , et al. , Red recombinaseassisted gene replacement in klebsiella pneumoniae. Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology, 2012. 39:P. 1219-1226]詳細描述。本發明通過兩輪PCR和一步克隆制備用于克雷伯氏肺炎桿菌同源重組的DNA片段，該片段攜帶短的同源臂，短同源臂外側添加保護序列的。短同源臂是直接設計到PCR引物上，通過引物合成而不用通過基因克隆獲得。將制備的線性DNA片段轉進攜帶pDK6-red質粒的克雷伯肺炎桿菌制作的電轉化感受態細胞中，在Red重組酶的幫助下，即可實現基因的重組替換。因此，本發明具有操作簡單、快速，能進行多次基因重組操作等優點，使克雷伯氏肺炎桿菌容易進行基因的敲除以及在染色體上添加基因，改變出發菌株的性能。
具體實施例方式以下實施例中使用的核酸內切酶、連接酶、一些基本質粒、PCR試劑以及DNA片段回收等采用商業產品，具體操作按照說明書進行。其他未注明的實驗操作按照常規分子操作方法進行。本發明通過用于同源重組的線性DNA片段的同源臂只有39到50堿基對，同源臂兩側連接有保護序列，保護序列是任意的DNA序列。在Red重組酶的輔助下，將上述線性DNA片段轉化入克雷伯氏肺炎桿菌細胞，進行基因重組，通過抗性篩選獲得重組子。具體的操作如下 克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞的制作參照“J.莎姆布魯克著，黃培堂譯《分子克隆實驗指南》科學出版社2005”中的所述大腸桿菌電擊轉化感受態細胞制作方法制作，而區別在于當細胞培養30min后加入終濃度為0. 7mmol/L的EDTA (乙二胺四乙酸)繼續培養細胞，直到0D600達到0.7時收集細胞制作感受態細胞。具體詳見[魏東，等.克雷伯氏肺炎桿菌電擊轉化條件的優化，中國釀造，2012. 31(4) :18-20]。攜帶pDK6_red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌菌株感受態細胞的制備與不攜帶pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌菌株感受態制備相似，只是在細胞培養30min后不僅加A EDTA還要加入終濃度0. 8mmol/L的IPTG來誘導Red重組酶的表達。pDK6-red質粒轉入克雷伯氏肺炎桿菌菌株取pDK6_red質粒與克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞混合，使用2mm的電轉杯在2kV的電壓下電擊轉化，見[魏東,等.克雷伯氏肺炎桿菌電擊轉化條件的優化，中國釀造，2012. 31(4): 18-20]，利用卡那霉素抗性篩選，獲得攜帶pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌菌株。而線性DNA電擊轉化攜帶pDK6_red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌與質粒轉入克雷伯肺炎桿菌中的方法相同，轉化后用線性DNA片段上攜帶的抗性標記進行篩選，獲得線性DNA與基因組染色體發生替換的重組菌株。同源重組片段的制備分為兩輪PCR和一步克隆完成。第一輪PCR :參照文獻[Gust B. , et al. , PCR-targeting system instreptomyces coelicolor A3 (2). John Innes Centre:Norwich, 2002.]的描述設計引物，引物的5’端是短的同源序列，以攜帶抗性基因的質粒為模板，擴增抗性基因，如果需要重組后消除抗性標記，則待擴增的抗性基因兩端需添加FRT序列。克隆將第一輪PCR擴增的片段通過TA克隆與克隆質粒連接，轉化大腸桿菌，篩選陽性重組子。第二輪PCR :在克隆位點上下游設計引物，以克隆篩選得到的陽性重組子為模板，擴增得到同源臂兩端分別添加保護序列的同源重組片段。利用電擊的方法將同源重組片段轉化入攜帶pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞中。培養轉化細胞，利用抗性或其他標記對轉化細胞進行篩選，挑出重組子。篩選得到的重組子可以進行下一輪的基因重組操作重組子再次按照上述方法制備感受態細胞。選用攜帶其他抗性或選擇標記的質粒為模板，按照上述的方法制備敲除其他基因的同源重組片段。這樣就可以在同一株菌中進行多次基因重組，得到一株具有多種選擇標記的重組子。 下面再舉具體實例對本發明方法予以說明。實例I利用本發明的方法，在克雷伯氏肺炎桿菌GMCC1. 6366菌株(GMCC1. 6366菌株為中國普通微生物保藏中心保藏，具有氨芐青霉素抗性)中敲除依賴于ATP的二羥基丙酮激酶基因dhakl,具體步驟如下I) GMCCI. 6366感受態細胞的制備按照如上所述的具體實施方式
中的“克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞的制作”進行
操作。 2) pDK6-red 質粒轉入 GMCC1. 6366 菌株取pDK6_red質粒2 ii L，與制備好的100 U L GMCCI. 6366感受態細胞混合，設定電壓2000伏特，利用2mm電轉杯進行電擊轉化操作。轉化后，細胞加入Iml的LB液體培養基37°C搖床，200轉/min復蘇I小時。然后，涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固體平板上，37 °C過夜培養，挑選長出的菌落10個，提取質粒，通過電泳進行驗證，10個菌落都正確，命名為 GMCC1. 6366-pDK6-red。3) GMCCI. 6366-pDK6_red 感受態細胞的制備與GMCC1. 6366感受態細胞制備方法相同，僅在細胞培養30min后添加IPTG(異丙基-3-D-硫代半乳糖苷)至終濃度0. 8mmol/L04)用于進行染色體上dhakl基因重組的DNA片段制備。具體操作如下a.設計引物dhakl-FRT-sl和dhakl-FTR-al，引物的5’端是與目的基因同源的39或40bp的堿基，而3’端是含有與抗性盒同源的序列，序列分別為ATGTCTCAATTCTTTTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT CATTCCGGGGATCCGTCGACC (如 SEQ ID NO. 2 所示)和 GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGTTCGCCGTGGATGCCCATT TGTAGGCTGGAGCTGCTTC (如 SEQ ID NO. 3 所示)。其中，弓丨物dhakl-FRT-sl 的ATGTCTCAAITCmTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT序列和引物dhakl-FTR-al的 GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGITCGCCGTGGATGCCCAIT 序列與 dhakl 基因同源。利用引物dhakl-FRT-sl和dhakl-FTR-al，以質粒pIJ773為模板，利用PCR擴增出長約I. 5kb的DNA片段A。該片段的兩端分別具有與dhakl上游和下游部分序列同源的同源臂，中間包含了來源于PIJ773的安普霉素抗性基因aac (3) IV，并且在aac (3) IV基因兩側具有FRT序列(如SEQ ID NO. I 所示)。b.回收上一步擴增的抗性基因，按照寶生物工程有限公司的pMD18_t simple試劑盒的方法進行連接。c.篩選陽性克隆。將步驟b獲得的連接產物加入到制作好的大腸桿菌感受態細胞中，進行轉化。轉化后，涂布在含氨芐青霉素的LB平板上過夜培養，氨芐青霉素用量為50mg/L。待平板上長出單菌落后，挑取單菌落接種在氨芐青霉素的試管中培養，然后，提質粒進行電泳驗證。提取的6個質粒中有一個為假陽性，其余5個均為陽性克隆，得到的陽性克隆命名為pMD18-t-kl。d.設計引物 pMD18t-s4 和 pMD18t_a4，序列分別為GACGGTGAAAACCTCTGACACATGC(如 SEQ ID NO. 4 所示)和 TGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC (如 SEQ ID NO. 5 所示)。利用引物pMD18t-s4和pMD18t-a4，以質粒pMD18_t_kl為模板進行PCR，獲得2. 3kb的DNA片段，即同源重組片段。引物的位點分別位于TA克隆位點上下游各409bp處，因此擴增得到的DNA片段兩端是來源于pMD18-t simple的409bp保護序列，與保護序列連接的是與dhakl同源的39或40bp的同源臂，同源臂的內側連接的是FRT序列，而FRT序列之間的是aac (3) IV基因。5)上述獲得的同源重組DNA片段電擊轉化GMCC1. 6366-pDK6_red感受態細胞。取DNA片段2 ii L，與制備好的100 u L GMCCI. 6366-pDK6_red感受態細胞(菌體OD6tltl值30)混合，使用2mm電轉杯,設定電壓2kv進行電擊轉化。轉化后,加入Iml的LB液體培養基于37°C, 200轉/min搖床復蘇I小時。然后，涂布在添加有50mg/L的安普霉素的LB固體平 板，37 °C過夜培養。6)重組菌的驗證。設計驗證引物dhakls和Yanzheng773z,序列分別為CCGATGCACTGCGGCTAT (如 SEQ ID NO. 6 所示)和 GCAAATACGGCATCAGTTACC (如 SEQ ID NO. 7所示)。其中，Yanzheng773z對應安譜霉素抗性基因aac (3) IV中間的一段序列。利用引物dhakls和Yanzheng773z，以長出的菌株總DNA為模板進行PCR，產物DNA片段為700bp，而以出發菌株(CGMCC1. 6366)總DNA為模板進行PCR無特異性條帶，表明獲得的重組菌為陽性，命名為 GMCC1. 6366-pDK6-red-dhakl。通過以上過程獲得的GMCC1. 6366-pDK6-red-dhakl菌株，是克雷伯氏肺炎桿菌GMCC1. 6366染色體上依賴于ATP的二羥基丙酮激酶基因dhakl與制備的含有同源臂的線性DNA片段的發生同源重組，使得染色體上的dhakl基因部分序列被安普霉素抗性基因替換，實現了菌株染色體上dhakl基因的敲除。由于該菌株具有核酸外切酶的活性，所以在同源臂的5’端添加了 400bp左右的保護序列以供宿主消化，而宿主的消化能力有限，同源臂受到了保護。這樣即可以發生同源重組。本發明獲得的GMCC1. 6366-pDK6-red-dhakl菌株，由于該菌株染色體dhakl基因敲除失活，是研究依賴于ATP的二羥基丙酮激酶功能的材料。綜上所述，本發明主要通過1)利用PCR擴增抗性基因DNA片段，其中在PCR引物上設計添加需要進行重組的基因的同源序列，獲得兩端連接有目的重組基因短同源臂的抗性基因DNA片段；2)將擴增的抗性基因片段連接到克隆質粒，將連接產物轉化至大腸桿菌中，經篩選，得到陽性克隆質粒；3)設計PCR引物，以步驟2)得到的陽性克隆質粒為模板，擴增包含抗性基因、短同源臂以及相鄰的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段；4)將步驟3)獲得的同源重組DNA片段，電擊轉化至含有pDK6red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞內，通過抗性篩選獲得陽性重組子。該方法不需要將目的重組基因克隆，簡單、快捷，且能進行多次基因操作。因此，具有廣泛的應用前景。
權利要求
1.一種利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，其特征在于，包括以下步驟 O以攜帶第一抗性基因的質粒為模板，進行PCR擴增，獲得第一抗性基因片段； 其中，PCR擴增引物的5’端設計成與需要進行重組的基因序列同源的序列，PCR擴增引物的3’端設計成與需要擴增的抗性基因兩側同源的序列，使擴增獲得的DNA中間為第一抗性基因，第一抗性基因的兩側連接有用于進行基因重組的短的同源序列； 2)將擴增的第一抗性基因片段與克隆質粒連接后，將連接產物轉化至大腸桿菌中，經篩選，得到陽性克隆質粒； 3)以步驟2)的克隆質粒上的克隆位點上下游序列作為保護序列，設計PCR擴增引物，并以步驟2)得到的陽性克隆質粒為模板，進行PCR擴增，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段，該同源重組DNA片段中間為抗性基因，抗性基因兩側是短同源臂，短同源臂兩側是來源于克隆質粒上的序列； 4)將步驟3)獲得的同源重組DNA片段，電擊轉化至含有pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞內； 5)將步驟4)的轉化后的克雷伯氏肺炎桿菌細胞進行培養，抗性篩選獲得陽性重組子，從而獲得基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細胞。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，攜帶第一抗性基因的質粒包括攜帶安譜霉素抗性的質粒，攜帶鏈霉素抗性的質粒，攜帶四環素抗性的質粒，或攜帶氯霉素抗性的質粒。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，短的同源序列是指設計在PCR引物上的、與需要進行重組的目的基因同源的序列，長度在39到50堿基。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，保護序列是任意的DNA序列。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述保護序列是長度為200-2000堿基對的保護序列。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述保護序列是長度為400-700堿基對的保護序列。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于還包括步驟5)獲得的基因重組的克雷伯氏肺炎桿菌細胞，通過利用攜帶第N抗性基因的質粒，重新按照步驟I) 5)進行操作，制備同時攜帶第N抗性基因的同源重組DNA片段，以進行第二次或多于兩次的基因重組操作； 其中，攜帶第N抗性基因的質粒中，N是大于或等于2的整數，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；該攜帶第N抗性基因的質粒包括攜帶氯霉素抗性的質粒、攜帶四環素抗性的質粒、攜帶鏈霉素抗性的質粒或攜帶安普霉素抗性的質粒。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法中，當需要重組后將抗性基因消除時，在步驟I)中加入如下步驟 在抗性基因的兩端添加如SEQ ID NO. I所示的FRT序列。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟5)中的陽性重組子，能通過卡那霉素篩選質粒pDK6-red丟失的克雷伯氏肺炎桿菌的菌株，然后，轉進pDK6-flp質粒來消除插入染色體的兩端連接FRT序列的抗性基因，獲得消除抗性標記的菌株；其中 ，該消除抗性標記的菌株，再通過卡那霉素篩選丟失質粒pDK6-flp的菌株后，再轉進質粒pDK6-red后，能按照如權利要求I所述的方法，重新進行基因同源重組操作。
全文摘要
本發明公開了一種利用短同源序列進行克雷伯氏肺炎桿菌基因重組的方法，包括1)PCR擴增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重組基因的同源序列；2)抗性基因片段與克隆質粒連接后，轉化至大腸桿菌中，經篩選得到克隆質粒；3)以步驟2)得到的克隆質粒為模板，設計引物PCR擴增包含抗性基因、短同源臂以及相鄰的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重組DNA片段；4)將同源重組DNA片段電擊轉化至含有pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞內；5)轉化后的克雷伯氏肺炎桿菌細胞進行培養，篩選獲得陽性重組子。該方法不需要將目的重組基因克隆，簡單、快捷，且能進行多次基因操作，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102952793SQ20121038854
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月12日 優先權日2012年10月12日
發明者郝健, 魏東, 柳鵬福, 史吉平, 姜標 申請人:上海中科高等研究院