專利名稱：生產高效降解飼料底物的木聚糖酶的米曲霉及生產木聚糖酶的方法
技術領域：
本發明涉及發酵領域，具體地，涉及能生產高效降解飼料底物的木聚糖酶的米曲霉及生產木聚糖酶的方法。
背景技術：
我國飼料資源中玉米供應日趨緊張，使用麥類飼料作為能量飼料越來越受到重視。在小麥、大麥、高粱等植物性飼料原料中存在著大量的非淀粉多糖(NSPS)，特別是阿拉伯木聚糖，對動物消化吸收存在一定的抗營養作用，使飼料營養成分尤其是脂肪和蛋白質不能被充分消化吸收，最終導致營養物質的消化吸收率下降。此外，食糜在小腸的滯留會引起微生物的異常繁殖，使動物生長受阻，表觀代謝能(AME)受到抑制。木聚糖酶(xylanase)是指可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β -1, 4-木聚糖酶、內切β-1，4-木聚糖酶和β-木聚糖酶。它可以將飼料中的非淀粉多糖(NSPS)分解成較小聚合度的低聚木糖，從而改善飼料性能，消除或降低非淀粉多糖在動物腸胃中因粘度較大而引起的抗營養作用；同時它可以破壞植物細胞壁的結構，提高內源性消化酶的活性，提高飼料養分的利用表觀代謝能(AME);另外還可以減少微生物的定植、維持腸道正常結構，取得了良好的社會效益和經濟效益。目前飼用酶制劑的生產主要有液態和固態發酵方式。固態發酵是高效生產酶制劑的方法之一，存在著很多優點，如單位體積的培養基的生產能力大大高于液態培養基；對工廠、機械設備和能源等的要求不高，操作成本低；培養基含水量小，不易污染雜菌等。目前，在木聚糖酶生產成本中培養基的成本占總成本的30% 40%，因此，利用廉價的培養基成分(特別是碳源)是降低木聚糖酶生產成本的關鍵。而農業廢棄物如玉米芯、秸桿、蔗渣、麩皮等既是碳源，又是固態發酵生產木聚糖酶的良好載體。

隨著研究的深入，固態發酵生產木聚糖酶的水平也得到了較大的提高。Lakshmi等(2009)報道了 Aspergillus terreus MTCC 8661固態發酵木聚糖酶活力可達到115000IU/g干物質，這是迄今為止木聚糖酶活力最高的報道。鄔敏辰等人(2007)報道了 Aspergillususamii利用麩皮、豆柏粉等農作物廢棄物為發酵基質，在28-32 °C發酵64_72h后，木聚糖酶活力達7783-9616IU/g，為目前國內報道的最高水平。然而，很多研究主要涉及木聚糖酶活力的提高，而沒有涉及木聚糖酶的實際應用功效，及木聚糖酶實際降解飼料的酶解效果。王前廣等人(2005)利用體外酶解法快速評定不同酶制劑在小麥型日糧中的應用效果，結果表明酶活高的木聚糖酶其體外應用效果并不一定好。這與本實驗室得到的試驗結果相一致。因此，僅僅通過提高木聚糖酶活力是不能評判飼用木聚糖酶的作用效果。這個問題阻礙了木聚糖酶在飼料工業中的生產與在養殖業中的規模使用。許多研究表明，體外模擬法是評價酶制劑品質的有效方法之一，體外法能夠在一定程度上反映酶制劑的作用效果，并與動物試驗結果有較強的一致性。動物試驗是準確評價酶制劑使用效果的方法。因此，飼用木聚糖酶的品質不僅僅是提高木聚糖酶活力，而且還要結合體外法對飼料底物的降解效果以及動物試驗的驗證。

發明內容
本發明是針對目前固態發酵木聚糖酶的研究只側重酶活的提高，而沒有涉及木聚糖酶的實際應用效果而提出并完成的。首先，本發明的目的是提供一種能夠高效降解飼料的木聚糖酶的菌株。本發明的再一目的是提供一種生產高效降解飼料的木聚糖酶的方法。根據本發明的能夠高效降解飼料的木聚糖酶的菌株米曲霉(Aspergi I Iusoryzae)Y_l 其保藏編號為 CGMCC No. 6842。米曲霉(Aspergillus oryzae)Y_l 自廣東珠海市飼料廠麩皮堆放處周圍土壤中分離得到。首先將土樣用馬鈴薯瓊脂培養基培養，然后用含有O. 5%木聚糖的馬鈴薯瓊脂培養基進行初篩，最后固態發酵木聚糖酶進行復篩，最終得到米曲霉Y-1。米曲霉Y-1質地疏松，初白色、黃色，后變為褐色至淡綠褐色，背面無色。分生孢子頭放射狀，層球形或近球形。根據本發明的生產高效降解飼料的木聚糖酶的方法包括通過發酵上述米曲霉(Aspergillus oryzae) Y-1得到木聚糖酶的步驟。根據本發明的生產高效降解飼料的木聚糖酶的方法，其中，米曲霉(Aspegillusoryzae) Y-1在固態培養基上發酵。所述固態培養基為麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5% (m/m)，料水比1:1-1. 2 (m/m)的發酵培養基。根據本發明的生產高效降解飼料的木聚糖酶的方法，其中，發酵工藝為采用曲房多層固態發酵方法，將孢子懸浮液噴灑至固態發酵培養基中，攪拌均勻，調節空氣溫度在30-32°C，控制相對濕度80%-95%的條件下培養72_84h，然后于45_50°C下低溫干燥。本發明所提供的木聚糖酶，具有高效降解飼料的能力，即在相同條件下應用于體外酶解飼料原料，較其它市售商品木聚糖酶具有顯著的酶解效果(以凈還原糖為指標)。本發明所提供的木聚糖酶，具有顯著提高動物的生產性能，即動物試驗顯示小麥型日糧添加本發明的木聚糖酶后，動物的生產性能得到了顯著的提高。本發明所提供的由米曲霉(Aspergillus oryzae)Y_1產生的木聚糖酶具有高效降解飼料，顯著提高動物生產性能的能力，生產過程不產生廢水廢渣，無二次環境污染，設備簡單，生產成本低，可作為禽、畜、水產養殖動物的飼料添加劑，使用范圍廣。米曲霉(Aspergillus oryzae)Y_1于2012年11月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是CGMCC No. 6842。
具體實施例方式實施例1、菌種的分離、篩選1、分離、篩選所用的培養基分離培養基去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15_20g/L，pH自然，121°C滅菌 20min。初篩培養基在分離培養基中添加O. 5% (m/v)的樺木木聚糖(SigmaX4252_100G)，121°C 滅菌 20min。
復篩固體發酵培養基麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5%，(m/m),料水比 I 1-1. 2 (m/m)。121°C滅菌 30min。2、分離、篩選的方法及步驟將Ig從廣東珠海市飼料廠麩皮堆放處周圍土壤與9mL無菌水充分混勻，靜置30min后取ImL上層液作為微生物樣品。取ImL微生物樣品，梯度稀釋到10_3、10_4、10_5、10-6、10-7，各取50 μ I均勻涂布于分離培養基(PDA)上，30°C倒置培養72h，再通過稀釋涂板，菌落劃線等方法得到單一純化菌種。吸5μ L菌液滴在初篩培養基的中央，各重復一次。30°C，培養48h后用O. 4%的剛果紅給平板染色lOmin，然后用IM氯化鈉褪色lh。測定各菌落的透明圈直徑/菌落直徑(D/d)，依據(D/d)大小來選擇產酶菌株。選取(D/d)比值大的菌株進行復篩，固態發酵完成后測定木聚糖酶的活力。最終得到產木聚糖酶活力最高為1856U/g干曲的菌株米曲霉Y-1。米曲霉Y-1質地疏松，初白色、黃色，后變為褐色至淡綠褐色，背面無色。分生孢子頭放射狀，層球形或近球形。以下實施例中一、發酵菌種的制備菌種為發明人篩選保藏,本發明經篩選所用菌種為米曲霉(Aspergillus oryzae)Y-1 ;菌種的制備分一級菌種和二級菌種制備。—級菌種的制備將保藏菌種米曲霉Y-1劃線接種于麥芽汁斜面培養基上，30-32 0C恒溫培養箱中培養84-96h，用無菌水將斜面孢子沖洗干凈，轉移至裝有無菌玻璃珠的三角瓶中，震蕩打散，制備成孢子懸浮液。二級菌種的制備麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5% (m/m),每500mL三角瓶裝干料20g，料 水比1:1-1. 2 (m/m)，加水混勻，121 °C滅菌30min，冷卻，分別接一級菌種1. OmL，攪拌均勻，30-32°C恒溫培養箱中培養72_84h，用無菌水洗下孢子，制備成孢子懸浮液備用。二、發酵生產1、發酵方式采用曲房多層固態發酵方法，控溫、控濕、保持通氣。2、固態發酵培養基配制先將70%麩皮與30%玉米芯混合均勻，然后將固體基質與含有3%硫酸銨和1. 5%磷酸二氫鉀的營養鹽溶液按固體基質重量1:1-1. 2的比例攪拌均勻，裝入布袋中，經121°C滅菌35min。3、發酵培養待滅菌后的固態發酵培養基冷卻至常溫后，接固態培養基重量的10%-15%的二級菌種于固體發酵培養基中，攪拌均勻后進行發酵。曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個曲房托架上。發酵進行到20-24h，用無菌棒劃線翻曲。調節空氣溫度在30-32°C，控制相對濕度80%-95%的條件下培養72_84h。4、干燥將發酵結束的固體基質，在45_50°C下低溫氣流干燥，粉碎得到本發明的木聚糖酶。實施例2將實施例1分離的米曲霉Y-1接種于新鮮的麥芽汁斜面上，置于恒溫培養箱中30°C培養84-96h，待斜面長滿孢子后，加入適量的無菌水洗下孢子，制成一級種孢子懸液。在500mL的三角瓶中裝入麩皮14g，玉米芯6g，硫酸銨O. 6g，磷酸二氫鉀O. 3g，水20ml，121°C滅菌30min。冷卻后，接米曲霉Yl孢子懸液1. OmL，攪拌均勻，置于恒溫培養箱中30°C培養72-84h，待發酵培養基表面長滿孢子，用無菌水洗下孢子，制成二級種米曲霉孢子懸液。配制50kg干料發酵培養基(麩皮35kg,玉米芯15kg,硫酸銨1. 5kg,磷酸二氫鉀
O.5kg),加自來水50kg,混合機攪拌均勻，12TC滅菌35min。冷卻后,接米曲霉I孢子懸液5L均勻噴灑于發酵培養基中，攪拌均勻。采用多層曲盤發酵，曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個曲房托架上。調節空氣溫度在30-32°C，控制相對濕度80%-95%。發酵進行到20-24h，用無菌棒劃線翻曲，整個過程保持溫度和相對濕度，繼續培養48h后發酵結束。將發酵料于45-50°C下氣流干燥至含水量8-10%，送入粉碎機粉碎，檢驗合格后，裝Ikg錫紙袋包裝成成品。經測定，所得產品的木聚糖酶活力為2326U/g。實施例3將米曲霉Yl接種于新鮮的麥芽汁斜面上，置于恒溫培養箱中30°C培養84_96h，待斜面長滿孢子后，加入適量的無菌水將孢子洗下，制成一級種孢子懸液。在500mL的三角瓶中裝入麩皮14g,玉米芯6g,硫酸銨O. 6g,磷酸二氫鉀O. 3g,水20ml, 121°C滅菌30min。冷卻后，接米曲霉Yl孢子懸液1. OmL，攪拌均勻，置于恒溫培養箱中30°C培養72_84h，待發酵培養基表面長滿孢子，用無菌水洗下孢子，制成二級種黑曲霉孢子懸液。配制50kg干料發酵培養基(麩皮35kg,玉米芯15kg,硫酸銨1. 5kg,磷酸二氫鉀
O.5kg),加自來水55kg,混合機攪拌均勻，121°C滅菌35min。冷卻后,接米曲霉I孢子懸液6L均勻噴灑于發酵培養基中，攪拌均勻。采用多層曲盤發酵，曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個曲房托架上。調節空氣溫度在30-32°C，控制相對濕度80%-95%。發酵進 行到20h-24h，用無菌棒劃線翻曲，整個過程保持溫度和相對濕度，繼續培養48h后發酵結束。將發酵料于45-50°C下氣流干燥至含水量8-10%，送入粉碎機粉碎，檢驗合格后，裝Ikg錫紙袋包裝成成品。經測定，所得產品的木聚糖酶活力為2434U/g。實施例4將米曲霉Yl接種于新鮮的麥芽汁斜面上，置于恒溫培養箱中30°C培養84_96h，待斜面長滿孢子后，加入適量的無菌水將孢子洗下，制成一級種孢子懸液。在500mL的三角瓶中裝入麩皮14g,玉米芯6g,硫酸銨O. 6g,磷酸二氫鉀O. 3g,水20mL, 121°C滅菌30min。冷卻后，接米曲霉Yl孢子懸液1. OmL，攪拌均勻，置于恒溫培養箱中30°C培養72_84h，待發酵培養基表面長滿孢子，用無菌水洗下孢子，制成二級種黑曲霉孢子懸液。配制50kg干料發酵培養基(麩皮35kg,玉米芯15kg,硫酸銨1. 5kg,磷酸二氫鉀
O.5kg),加自來水60kg,混合機攪拌均勻，121°C滅菌35min。冷卻后,接米曲霉孢子懸液7L均勻噴灑于發酵培養基中，攪拌均勻。采用多層曲盤發酵，曲料厚度為3-4cm，曲盤水平放置，垂直間隔距離為O. 2m，均勻分布在整個曲房托架上。調節空氣溫度在30-32°C，控制相對濕度80%-95%。發酵進行到20h-24h，用無菌棒劃線翻曲，整個過程保持溫度和相對濕度，繼續培養48h后發酵結束。將發酵料于45-50°C下氣流干燥至含水量8-10%，送入粉碎機粉碎，檢驗合格后，裝Ikg錫紙袋包裝成成品。經測定,所得產品的木聚糖酶活力為2385U/g。
實施例5本發明的木聚糖酶與其它市售商品木聚糖酶對飼料體外酶解比較通過發酵本發明的米曲霉Yl制備的木聚糖酶，具有高效降解飼料的能力。體外酶處理飼料及其原料方法稱飼料或飼料原料IOg于300ml三角瓶中，按料水比1:10加入
O.1M pH5. 5的乙酸乙酸鈉緩沖液100ml，加酶量為50U/g飼料，于40°C恒溫振蕩酶解5h。反應結束后加入5ml 10%三氯乙酸處理lOmin，酶解液于4000r/min離心lOmin，收集上清液，DNS法測定還原糖含量。結果見表I。表I本發明的木聚糖酶與其它市售商品木聚糖酶對飼料體外酶解比較
權利要求
1.高效降解飼料的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株Y_l,其保藏編號為CGMCCNo. 6842。
2.—種生產高效降解飼料的木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括通過發酵權利要求I所述米曲霉(Aspegillus oryzae) Υ-1得到木聚糖酶的步驟。
3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,所述米曲霉(Aspergillusoryzae) Y-1在固態培養基上發酵，所述固態培養基為麩皮70%，玉米芯30%，硫酸銨3%，磷酸二氫鉀1. 5%(m/m),料水比1:1-1. 2 (m/m)的發酵培養基。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，采用固態發酵方法，將孢子懸浮液噴灑至固態發酵培養基中，攪拌均勻，調節空氣溫度在30-32 °C，控制相對濕度80%-95%的條件下培養72-84h，然后于45-50°C下低溫干燥。
全文摘要
本發明涉及發酵領域，具體地，涉及能生產高效降解飼料底物的木聚糖酶的米曲霉及生產木聚糖酶的方法。根據本發明的能夠高效降解飼料的木聚糖酶的菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)Y-1其保藏編號為CGMCC No.6842。發明所提供的由米曲霉(Aspergillus oryzae)Y-1產生的木聚糖酶具有高效降解飼料，顯著提高動物生產性能的能力，生產過程不產生廢水廢渣，無二次環境污染，設備簡單，生產成本低，可作為禽、畜、水產養殖動物的飼料添加劑，使用范圍廣。
文檔編號C12N9/42GK103060202SQ201210529320
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者周平發, 王敏, 崔細鵬, 謝志恒, 翁曉輝, 史寶軍 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司