專利名稱：高產酸性纖維素酶和淀粉酶的酵母菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，具體地涉及高產酸性纖維素酶和淀粉酶的酵母菌。
背景技術：
嗜酸菌是一類極其重要的極端微生物，主要分布在酸性礦山廢水、土壤和溫泉中。其中，酸性礦山廢水PH值通常在3以下，并含有高濃度的重金屬陽離子和硫酸根陰離子。嗜酸菌分泌的胞外酶往往是相應的嗜酸酶。由于其嗜酸特性，大量酸性酶被廣泛應用在酸性環境的工業中。例如，生淀粉降解的嗜酸淀粉酶、作為飼料添加劑的嗜酸木聚糖酶、嗜酸甘露聚糖酶以及嗜酸纖維素酶。在植物細胞壁中，纖維素是自然界中最豐富的可再生的生物質資源，約占地球上每年光合作用產生的生物質的一半。但是由于其結構復雜，單一酶很難有效降解，而且轉化效率低。在飼料行業，由于動物胃腸道處于酸性pH下，需要添加大量的微生物來源的酸性纖維素、半纖維素酶。另外，淀粉深加工是 農業副產品升值的主要途徑，淀粉質原料的水解在傳統工業上分液化和糖化二個步驟，工序復雜，成本高。而使用酸性淀粉酶與商業化酸性糖化酶一步雙酶法處理，能簡化制作工藝，提高發酵產物的高效轉化和出糖率。減低了工業勞動強度，增加了原料利用率，降低生產成本，提高生產效益。盡管嗜酸菌已被人們作為極端微生物的重要類群，但目前，對嗜酸菌的研究還主要集中在少數細菌和真菌，對酸性酵母菌的研究知之甚少。因此，進一步對嗜酸酵母菌進行更為廣泛深入的研究，以真正發揮其科學價值和應用價值。本發明從江西鈾礦微生物浸鈾尾液(pH2. 03. O)這一極端嗜酸環境中分離嗜酸酵母菌，并利用液體發酵的方法分析其產酶情況，結果發現紅冬孢酵母菌Rhodosporidium toruloidesstrain RBS-9產豐富的纖維素酶和淀粉酶，其最適PH3. O-4.0，在酸性和中性條件下具有很高的酶活力。為研究嗜酸酵母菌的產酶特性及后期應用提供了良好的科研材料。

發明內容
基于目前對嗜酸酵母菌研究不足，本發明的目的是從特色的嗜酸環境江西鈾礦微生物浸鈾尾液中分離產酸性酶的酵母菌株，從而研究嗜酸及產酶機制。本發明提供了高產酸性纖維素酶和淀粉酶的菌株，該細菌菌株命名為紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium SP. ) RBS-9，于2012年4月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是CGMCC No. 5987。根據本發明的具體實施方式
，從江西鈾礦微生物浸鈾尾液分離產酸性糖苷水解酶菌株，其分離方法是取樣品20mL，加入到80mL富集培養基(pH3. O)中30°C、160rpm振蕩培養72h后，分別轉接至馬鈴薯液體培養基以同樣的條件培養兩代，平行重復3次。取富集培養物在馬鈴薯固體培養基進行劃線稀釋，獲得單菌落，多次重復劃線稀釋以獲得純培養，斜面保藏于4°C冰箱。本發明的再一目的是提供一種產酸性纖維素酶和淀粉酶的液體發酵方法。因此,本發明還提供了上述紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium SP. ) RBS-9用于發酵制備酸性纖維素酶和淀粉酶的應用。根據本發明的具體實施方式
，上述酵母菌在PDB液體培養基(pH3. O)培養16h后獲得新鮮種子液，再將種子液按照1%的接種量轉入產酶培養基中，30°C，160rpm振蕩培養72h后，離心取上清液，利用不同酶標準測定方法測定其酶活，并利用不同pH緩沖液測定酶的最適pH。本發明首先所要解決的技術問題是克服現有對嗜酸環境微生物分離，提供一種產酸性酶的酵母菌株。本發明的菌株最適PH為3. 0，最適溫度30°C，其產酶在pH3. O 4. O都有較高的酶活性；可使其在需求酸性環境的工業生產上應用。


圖1菌株RBS-4所產葡萄糖苷酶的最適pH ；圖2菌株RBS-4所產纖維素酶的最適pH ；圖3菌株RBS-4所產淀粉酶的最適pH ；紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium SP.) RBS-9，于2012年4月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是CGMCC No. 5987。
具體實施例方式實施例1菌株分離富集培養基(g/L) (NH4) 2S043. O, KC10. 1，K2HPO4O. 5，MgSO4 · 7Η200· 5，Ca(NO3)2O. 01，FeSO4 · 7Η203· 0，葡萄糖 2，pH 值 2· O 2· 5。分離培養基(g/L) (NH4) 2S042. 0，KC10. 1，MgSO4 · 7Η200· 25，Ca(NO3)2O. 01，葡萄糖1.0，酵母提取物0. 1，pH值2. 5 3. O。馬鈴薯液體培養基200g馬鈴薯汁，20g葡萄糖，pH3. O。馬鈴薯固體培養基200g馬鈴薯，20g葡萄糖，25g瓊脂，pH3. O。取江西鈾礦微生物浸鈾的尾液10mL，加入到IOOmL富集培養基中30°C、160rpm振蕩培養72h后，挑取單菌落分別轉接至分離培養基以同樣的條件培養兩代，平行重復3次。取富集培養物在馬鈴薯固體培養基進行劃線稀釋，獲得單菌落，再多次重復劃線稀釋以獲得純培養。利用體視顯微鏡和相差顯微鏡觀察分離到菌株的菌落形態和菌體形態。RBS-9單菌落分離于馬鈴薯固體培養基，到3天時觀察發現，菌落表面柔軟，邊緣完整，呈粉紅色或紅色。邊緣光滑，無透明圈。細胞為圓形或橢圓形，出芽生殖，無假菌絲生成。本發明的菌株最適PH為3. O,生長溫度為30°C。經ITS序列比對發現其屬于紅冬孢酵母菌 Rhodosporidium toruloides,因此，將菌株 RBS-9 命名為分枝桿菌 Rhodosporidiumtoruloides strain RBS—9。實施例2菌株液體發酵產酶分析
纖維素酶類發酵培養基(g/L) (NH4)2S042. 0，K2HPO4L 0，；MgS04 · 7Η200· 5 ;麥麩10g，ρΗ3· O0淀粉酶類發酵培養基(g/L) (NH4)2S042. 0，K2HPO4L 0，；MgS04 · 7H200. 5 ;土豆淀粉10g，ρΗ3· O0DNS法具體方法如下在pH3. 0，50°C條件下，ImL的反應體系包括100 μ L適當的稀釋酶液，900 μ L底物(羧甲基纖維素鈉或可溶性淀粉)，反應IOminjpA1. 5mL DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻至室溫后于540nm測定OD值。I個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出I μ mo I還原糖的酶量。pNPG法底物對硝基苯β -D葡萄糖苷(pNPG)以2mM的濃度250uL溶于pH4. O緩沖液中，加入250uL適當稀釋的酶液，在50°C反應IOmin后，加入1. 5mLIMNa2CO3,在405nm下測定OD值。酶活單位定義為在最適溫度和條件下，每分鐘釋放lumol pNP所需要的酶量(U/mL)。用滅過菌的牙簽挑取馬鈴薯固體平板上的單菌落于發酵培養基中，30°C、220r/min、150mL/500mL的條件下振蕩培養72h，培養過程中觀察菌體生長狀況。發酵液在4°C下lOOOOr/min離心20min，上清液即為粗酶液，用于檢測β -葡萄糖苷酶、纖維素酶、淀粉酶等3種不同糖苷水解酶的酶活力。經測定，菌株培養72h后均可檢測到3中酶活力，分別為
3.2,8. 8，10. 2U/ml。實施例3不同酶的最適pH分離純化β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、淀粉酶，在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底物用不同pH的O. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中50°C下進行酶活力測定。結果表明，葡萄糖苷酶的最適pH為3.0，在pH2. 5飛.O有70%以上的相對酶活性(圖1)。纖維素酶的最適 pH為3. 5，在ρΗ3. (Γ5. O有60%以上的相對酶活性(圖2)。淀粉酶的最適pH為4. 5，在pH3. 5^5. 5有50%以上的相對酶活性(圖3)。以上結果表明，菌株RBS-9所產糖苷水解酶最適pH在酸性范圍內，并且在酸性及中性pH條件下具有較高的活性。
權利要求
1.高產酸性纖維素酶和淀粉酶的酵母菌，其特征在于，其保藏編號為CGMCCNo. 5987。
2.權利要求1所述高產酸性纖維素酶和淀粉酶的酵母菌用于發酵制備酸性纖維素酶和淀粉酶的應用。
3.一種產酸性纖維素酶和淀粉酶的液體發酵方法，其特征在于，所述方法包括步驟將權利要求1所述菌株在PH3. O的PDB液體培養基培養16h后獲得新鮮種子液，再將種子液按照1%的接種量轉入產酶復合培養基中，30°C，160rpm振蕩培養72h后，離心取上清液，利用不同酶的標準測定方法測定其酶活。
全文摘要
本發明涉及微生物領域，具體地涉及高產酸性纖維素酶和淀粉酶的酵母菌株，其保藏編號為CGMCC No.5987。本發明首先所要解決的技術問題是克服現有對嗜酸環境微生物分離，提供一種產酸性酶的菌株。本發明的菌株經鑒定為紅冬孢酵母菌，生長最適pH為3.0，其產酶在pH3.0～5.0都有較高的酶活性；可使其在需求酸性環境的工業生產上應用。
文檔編號C12N9/30GK103060209SQ20121055870
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者李江, 王學剛, 呂飛龍, 劉亞潔, 孫占學, 徐玲玲, 史維俊, 牛建國, 石鵬君, 姚斌 申請人:東華理工大學