專利名稱：具有免疫增強(qiáng)作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有良好的安全性且即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強(qiáng)作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料。
背景技術(shù)：
免疫是指當(dāng)從外界侵入的病毒或細(xì)菌，或者癌細(xì)胞等侵襲機(jī)體時(shí)，機(jī)體防御自己的機(jī)構(gòu)。免疫中參與多種細(xì)胞，其中由于巨噬細(xì)胞(macrophage)普遍存在于所有動(dòng)物中，并且參與免疫應(yīng)答的所有階段，尤其包括初期階段的作用，因此已經(jīng)認(rèn)識(shí)到其重要性。已經(jīng)了解到，如果免疫低下，則會(huì)引發(fā)癌、感染癥、過(guò)敏癥等各種疾病；反之，如果免疫被增強(qiáng)，則可以期待抑制癌癥發(fā)生、抗癌作用、抗感染癥、抗敏作用，特別是恢復(fù)身體狀態(tài)節(jié)律、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)等多種效果。鑒于此，以改善消費(fèi)者的健康狀態(tài)為目的，已在提供具有免疫增強(qiáng)作用的各種化合物及微生物。例如，可以列舉利用乳鐵蛋白的水解物的(例如，參照專利文獻(xiàn)I);利用甲殼素(例如，參照專利文獻(xiàn)2)、海藻糖(例如，參照專利文獻(xiàn)3)、巖藻聚糖硫酸酷(例如，參照專利文獻(xiàn)4)等糖類的；利用植物源物質(zhì)的(例如，參照專利文獻(xiàn)5);利用肽(例如，參照專利文獻(xiàn)6)、白細(xì)胞介素(例如,參照專利文獻(xiàn)7)的；利用核酸的(例如，參照專利文獻(xiàn)8);利用谷胱甘肽(例如，參照專利文獻(xiàn)9)、氨基酸(例如，參照專利文獻(xiàn)10)、多聚賴氨酸(例如，參照專利文獻(xiàn)11)的；利用腸內(nèi)細(xì)菌(例如，參照專利文獻(xiàn)12)、乳酸菌(例如，參照專利文獻(xiàn)13)、場(chǎng)球菌屬細(xì)菌(例如，參照專利文獻(xiàn)14)等微生物的化合物及微生物。另外，近年來(lái)，￠-葡聚糖(glucan)的免疫增強(qiáng)效果受到廣泛關(guān)注。例如，提出從酵母或蘑菇類提純￠-葡聚糖，并且利用該物質(zhì)的免疫增強(qiáng)方法(例如，參照專利文獻(xiàn)15、16)。然而，為了利用所述具有免疫增強(qiáng)作用的化合物而增強(qiáng)消費(fèi)者的免疫，必須大量提純而服用這種化合物，這需要多道制備エ序、大量勞動(dòng)カ及費(fèi)用。并且，所述具有免疫增強(qiáng)作用的微生物中，存在性狀未知的微生物，并且還有不適合用于食品的微生物。另外，如果所述具有免疫增強(qiáng)作用的微生物其本身不能直接利用于食品制造(發(fā)酵等)，則為了使食品具備免疫增強(qiáng)功能，需要向食品単獨(dú)添加該微生物。在此，已經(jīng)公開(kāi)有，由于酵母的染色體上的基因中，MCD4基因、GASl基因以及CWH41基因中的ー個(gè)或兩個(gè)以上的基因被破壞，而導(dǎo)致具有免疫增強(qiáng)作用的酵母(例如，參照專利文獻(xiàn)17)。根據(jù)所述專利文獻(xiàn)17所公開(kāi)的酵母，如同所述專利文獻(xiàn)15、16中記載的技術(shù)那樣，無(wú)需從酵母特意地提純3 -葡聚糖，而即使直接服用該酵母，也能夠增強(qiáng)免疫。然而，對(duì)于專利文獻(xiàn)17中公開(kāi)的酵母而言，所述特定的基因是根據(jù)基因重組技術(shù)而被破壞的。近年來(lái)，隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，安全性已被鑒定的基礎(chǔ)上，已有多種轉(zhuǎn)基因食品得到認(rèn)可，甚至在銷售。但是，從消費(fèi)者的角度來(lái)看，對(duì)于被基因重組的食物的安全性，仍然有較高的恐懼感。因此，現(xiàn)階段，以食用用途為目的利用所述專利文獻(xiàn)17的酵母，在應(yīng)用上是具有難度的。而且，專利文獻(xiàn)17中公開(kāi)的酵母，由于與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因缺損，因此如預(yù)期的那樣，已經(jīng)證實(shí)，該酵母在低滲透壓的培養(yǎng)基中增殖極其緩慢。因此，在培養(yǎng)所述酵母時(shí)，為了避免向結(jié)構(gòu)已變得脆弱的細(xì)胞壁施加負(fù)荷，需要在培養(yǎng)基中添加例如糖類等物質(zhì)來(lái)提高培養(yǎng)基的滲透壓，使得培養(yǎng)基與酵母細(xì)胞膜內(nèi)的溶液的滲透壓變?yōu)橄嗤@需要培養(yǎng)成本。并且，將所述酵母應(yīng)用在例如面包等食品的發(fā)酵時(shí)，存在發(fā)酵條件受限制、以及為了使發(fā)酵液變?yōu)榈葔憾砑犹穷悤r(shí)食品風(fēng)味被改變等問(wèn)題。另外，人工誘變方法是指根據(jù)例如誘變劑、紫外線照射、放射線照射等誘變因素，而相比于自然突變，以更高頻率引起DNA突變的方法。所述人工誘變方法不同于所述基因重組技木，其不會(huì)插入食物原本具有的堿基序列以外的堿基序列。因此，根據(jù)所述人工誘變方法而遺傳性狀被改變的食物，在目前來(lái)看，由于安全性比較高而被消費(fèi)者所接受。因此，到目前為止的現(xiàn)狀是，還沒(méi)有提供具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強(qiáng)作用、便宜且易購(gòu)得、食品制造中可以直接利用、且在低滲透壓下也能夠培養(yǎng)的酵母等微生物，并且迫切期望能夠早日提供。專利文獻(xiàn)1:專利公開(kāi)公報(bào)平5-178759號(hào)專利文獻(xiàn)2 :專利公開(kāi)公報(bào)平6-271470號(hào)專利文獻(xiàn)3 :專利公開(kāi)公報(bào)2003-81839號(hào)專利文獻(xiàn)4 :專利公開(kāi)公報(bào)2001-181303號(hào)專利文獻(xiàn)5 :專利公開(kāi)公報(bào)平6-56685號(hào)

專利文獻(xiàn)6 :專利公 報(bào)第2873434號(hào)專利文獻(xiàn)7 :專利公報(bào)2002-3395號(hào)專利文獻(xiàn)8 :專利公報(bào)第2529605號(hào)專利文獻(xiàn)9 :專利公開(kāi)公報(bào)平11-49696號(hào)專利文獻(xiàn)10 :專利公開(kāi)公報(bào)2000-281571號(hào)專利文獻(xiàn)11 :專利公開(kāi)公報(bào)2003-128589號(hào)專利文獻(xiàn)12 :專利公開(kāi)公報(bào)平6-56678號(hào)專利文獻(xiàn)13 :專利公開(kāi)公報(bào)平7-228536號(hào)專利文獻(xiàn)14 :專利公開(kāi)公報(bào)平11-92389號(hào)專利文獻(xiàn)15 :專利公開(kāi)公報(bào)2001-354570號(hào)專利文獻(xiàn)16 :專利公開(kāi)公報(bào)2003-183176號(hào)專利文獻(xiàn)17 :專利公開(kāi)公報(bào)2006-75039號(hào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的諸多問(wèn)題，并以達(dá)到以下目的作為課題。即，本發(fā)明的目的在于提供ー種具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強(qiáng)作用、便宜且容易購(gòu)得、食品制造中可以直接利用、并且在低滲透壓下也能夠培養(yǎng)的酵母，以及含有該酵母的食品或飼料。
為了解決上述課題，本發(fā)明的發(fā)明者們努力探討的結(jié)果，得到了以下見(jiàn)解。S卩，對(duì)于目前廣泛地應(yīng)用在食品制造中的酵母，根據(jù)利用甲基磺酸こ酯的人工誘變方法來(lái)使酵母染色體上發(fā)生突變時(shí)，能夠獲得細(xì)胞壁的甘露聚糖少的酵母；該酵母由于細(xì)胞壁的甘露聚糖少的原因，￠-葡聚糖暴露在菌體表面，因此即使不專門(mén)從酵母提純￠-葡聚糖，而直接用在免疫增強(qiáng)作用試驗(yàn)，也表現(xiàn)出顯著的免疫增強(qiáng)作用；該酵母雖然細(xì)胞壁的甘露聚糖少，但是具有預(yù)料不到的效果，即對(duì)低滲透壓表現(xiàn)出較高的耐性，適用于酵母制備(培養(yǎng))以及含有該酵母的食品和飼料的制造。本發(fā)明是基于發(fā)明人們的以上見(jiàn)解而完成的，作為解決上述課題的技術(shù)手段如下。<1>酵母的特征在干，細(xì)胞壁甘露聚糖少，具有免疫增強(qiáng)作用，能夠在滲透壓為300m Osm的YPD液體培養(yǎng)基中増殖。<2>所述〈1>中記載的酵母的特征在于，免疫增強(qiáng)作用是巨噬細(xì)胞活化作用。<3>所述〈1>至〈2>任意ー項(xiàng)中記載的酵母的特征在于，根據(jù)人工誘變方法獲得免疫增強(qiáng)作用。<4>所述〈1>至〈3>任意ー項(xiàng)中記載的酵母的其特征在干，未被基因重組。<5>所述〈3>至〈4>任意ー項(xiàng)中記載的酵母的特征在于，在人工誘變方法中使用的未株為 Saccharomyces cerevisiae。<6>所述〈3>至〈5>任意ー項(xiàng)中記載的酵母的特征在于，人工誘變方法是利用誘變齊U、紫外線照射以及放射線照射中的任意ー種的方法。<7>所述〈1>至〈6 >任意一項(xiàng)中記載的酵母的特征在于，該酵母是Saccharomycescerevisiae FERM BP-11293 以及 Saccharomyces cerevisiaeFERM BP-11294 中的任意一種。<8>含有所述〈1>至〈7>任意ー項(xiàng)中記載的酵母的食品或者飼料。根據(jù)本發(fā)明，能夠解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的諸多問(wèn)題，且可以提供具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強(qiáng)作用、便宜且容易購(gòu)得、食品制造中可以直接利用、并且在低滲透壓下也能夠培養(yǎng)的酵母，以及含有該酵母的食品或飼料。


圖1為突變體f 4的顯微鏡圖像；圖2為示出關(guān)于突變體廣4的巨噬細(xì)胞活化作用試驗(yàn)的結(jié)果的圖；圖3A為示出關(guān)于突變體3以及親株的增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖；圖3B為示出關(guān)于突變體3以及親株的增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖；圖4為示出關(guān)于記載在專利公開(kāi)公報(bào)2006-75039中的變異體(MCD4 A株)的增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖；圖5為示出根據(jù)實(shí)施例6、7制造的含有突變體3的食品的巨噬細(xì)胞活化試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式(酵母)
本發(fā)明的酵母的特征在于，細(xì)胞壁的甘露聚糖少，并且具有免疫增強(qiáng)作用，而且能夠在滲透壓為300m Osm (0SM0L，滲量)的YPD液體培養(yǎng)基中増殖。<免疫增強(qiáng)作用>所述免疫增強(qiáng)作用是，增強(qiáng)自然免疫的作用。所述自然免疫是指，機(jī)體所具備的免疫中，機(jī)體先天具備而起到即使事先未暴露在抗原中也能夠?qū)⑺隹乖瓘臋C(jī)體排除的作用的機(jī)構(gòu)。作為所述抗原，只要不影響本發(fā)明的效果，就沒(méi)有特別的限制。例如可以列舉，病毒、細(xì)菌等外來(lái)抗原以及癌細(xì)胞等內(nèi)在抗原。作為所述免疫增強(qiáng)作用，只要能夠增強(qiáng)所述自然免疫，就沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如可以列舉，吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、單球、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)、抗原呈遞細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、多形核白細(xì)胞(嗜酸球、嗜堿球、月巴大細(xì)胞)等活化作用。其中，基于普遍存在于各種生物中且排除抗原的效果較高的原因，優(yōu)選為所述巨噬細(xì)胞的活化作用。作為評(píng)價(jià)所述酵母具有所述免疫增強(qiáng)作用的方法，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)與自然免疫有關(guān)的所述細(xì)胞的種類，從現(xiàn)有的公知的評(píng)價(jià)方法中適當(dāng)選擇。例如，對(duì)所述巨噬細(xì)·胞的活化作用的評(píng)價(jià)，可以根據(jù)如下方法來(lái)進(jìn)行。即，通過(guò)將巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)基或者緩沖液中接觸所述酵母而刺激所述巨噬細(xì)胞，并測(cè)定在刺激前后所述巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(例如，TNF-a等)的量。所述酵母具有免疫增強(qiáng)作用的原因被認(rèn)為是，由于細(xì)胞壁的甘露聚糖少，從而導(dǎo)致具有免疫增強(qiáng)作用的3-葡聚糖暴露在菌體表面。<甘露聚糖>通常，甘露聚糖是構(gòu)成酵母的細(xì)胞壁的主要成分之一，是以D-甘露糖為主鏈的糖鏈。甘露聚糖與蛋白質(zhì)結(jié)合而以甘露聚糖蛋白質(zhì)形態(tài)存在。在酵母的細(xì)胞壁中，沿著細(xì)胞膜的外周面形成有￠-葡聚糖層，所述甘露聚糖蛋白質(zhì)通過(guò)稱為糖基化磷脂酰肌醇(GPI，glycosylphosphatidylinositol)錨的糖脂類與該P(yáng) -葡聚糖結(jié)合。其結(jié)果，甘露聚糖覆蓋而隱藏￠-葡聚糖，并存在于細(xì)胞壁的最外層(即，菌體表面)。對(duì)此，本發(fā)明的所述酵母中，由于細(xì)胞壁的甘露聚糖少，因此P -葡聚糖代替甘露聚糖暴露在菌體表面。所述酵母，其細(xì)胞壁上甘露聚糖少的原因尚未證實(shí)，但是被認(rèn)為是例如，甘露聚糖、甘露聚糖蛋白質(zhì)及GPI錨中的至少ー種未被合成；雖然已被合成但沒(méi)有運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜外；相結(jié)合的部位發(fā)生缺損或突變等原因造成的。確認(rèn)所述酵母中細(xì)胞壁甘露聚糖少時(shí)，例如可以利用，甘露聚糖特異性抗體、與甘露聚糖中的D-甘露糖、甲基-a -D-吡喃甘露糖苷等特異性結(jié)合的ConA (刀豆蛋白A)凝集素等物質(zhì)來(lái)確認(rèn)。具體來(lái)講，將所述抗體或者所述ConA利用異硫氰酸熒光素(FITC，F(xiàn)luorescein isothiocianate)等突光色素標(biāo)記后,根據(jù)所述突光來(lái)檢測(cè)結(jié)合于菌體表面的所述抗體或者所述ConA。此時(shí),如果沒(méi)有檢測(cè)出根據(jù)所述抗體或者所述ConA結(jié)合到菌體表面而產(chǎn)生的熒光，則可以判定為細(xì)胞壁甘露聚糖少。對(duì)于所述熒光的檢測(cè)，可以通過(guò)熒光顯微鏡下觀察的方法來(lái)進(jìn)行，也可以利用例如流式細(xì)胞儀、熒光分析儀等裝置來(lái)以定量分析的方法來(lái)進(jìn)行。并且，確認(rèn)所述酵母中細(xì)胞壁甘露聚糖少時(shí)，例如可以根據(jù)對(duì)細(xì)胞壁甘露聚糖的含量進(jìn)行定量分析的方法來(lái)確認(rèn)。作為對(duì)甘露聚糖含量的定量分析方法，沒(méi)有特別限制，例如可以根據(jù)以下的順序進(jìn)行。S卩，首先，利用玻璃珠來(lái)破碎細(xì)胞，通過(guò)離心調(diào)整細(xì)胞壁物質(zhì)并冷凍干燥。其次，根據(jù)Dallies們的方法(Yeast，1998，14，P1297_1306)進(jìn)行硫酸水解，將中和后的上清液凍結(jié)干燥，并利用 REZEXTM RPM-Mono sac char i de Phenomenex (ShimadzuGLC LTD)等色譜柱以高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分析，根據(jù)得到的葡萄糖與甘露糖的比值，能夠得到細(xì)胞壁中的甘露聚糖的含量。作為細(xì)胞壁中甘露聚糖的含量，只要以￠-葡聚糖暴露于菌體表面的程度少時(shí)，沒(méi)有特別限制，但是更加優(yōu)選為，細(xì)胞壁中不含有甘露聚糖。所述￠-葡聚糖是構(gòu)成酵母的細(xì)胞壁的主要成分之一，是由葡萄糖通過(guò)￠1-3結(jié)合的糖鏈。作為所述P -葡聚糖的平均分子量及修飾實(shí)施形態(tài)，只要具有免疫增強(qiáng)作用，就沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)酵母的種類和培養(yǎng)條件而變更。作為確認(rèn)所述酵母中￠-葡聚糖暴露在菌體表面的方法，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以利用￠-葡聚糖特異性抗體、苯胺藍(lán)等熒光試劑來(lái)確認(rèn)。另外，可以利用電子顯微鏡觀察菌體表面的3-葡聚糖纖維來(lái)確認(rèn)。<對(duì)滲透壓的耐性>通常，包括酵母的一部分微生物、植物具有細(xì)胞壁，這種細(xì)胞壁具有對(duì)滲透壓的耐性、維持細(xì)胞形態(tài)等極其重要的功能。鑒于此，本發(fā)明的所述酵母，由于如上所述其細(xì)胞壁中的甘露聚糖少，因而可能會(huì)喪失對(duì)滲透壓的耐性。但是，在后述的實(shí)施例中可以證實(shí)，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人們制備的酵母，具有預(yù)料不到的 效果，即具有對(duì)滲透壓的耐性。作為表示本發(fā)明的所述酵母對(duì)滲透壓具有耐性的指標(biāo)，只要不影響本發(fā)明的效果，就沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。但是優(yōu)選的指標(biāo)為，能夠在滲透壓為300m0sm(OSMOL,滲量)的YPD液體培養(yǎng)基中増殖。在此，所述YPD液體培養(yǎng)基是使用由I質(zhì)量％的酵母膏、2質(zhì)量％的蛋白胨，2質(zhì)量％的葡萄糖組成的培養(yǎng)基。并且，用在所述YPD液體培養(yǎng)基中的酵母膏是使用東方酵母エ業(yè)(株式)會(huì)社制備的酵母膏，蛋白胨是使用日本制藥(株式)會(huì)社制備的蛋白胨，葡萄糖是使用國(guó)產(chǎn)化學(xué)(株式)會(huì)社制備的葡萄糖。所述滲透壓例如可以根據(jù)山梨醇等非發(fā)酵性糖類、NaCl等物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)。所述滲透壓例如可以利用滲透壓計(jì)F-2000 (roebling公司造)來(lái)測(cè)定。本發(fā)明中“能夠増殖”是指，將屬于高滲透壓培養(yǎng)基的YPDS液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的一部分培養(yǎng)液添加到所述YPD液體培養(yǎng)基，使OD66tl達(dá)0. 1，然后在適宜條件下震蕩培養(yǎng)吋，24小時(shí)培養(yǎng)后的OD66tl達(dá)到1. 0以上。在此，所述YPDS液體培養(yǎng)基是使用由I質(zhì)量％的酵母膏、2質(zhì)量％的蛋白胨，2質(zhì)量％的葡萄糖、5. 5質(zhì)量％ (0. 3mol/L)的山梨醇組成的培養(yǎng)基。并且，用在所述YPDS液體培養(yǎng)基中的酵母膏是使用東方酵母エ業(yè)(株式)會(huì)社制備的酵母膏，蛋白胨是使用日本制藥(株式)會(huì)社制備的蛋白胨，葡萄糖是使用國(guó)產(chǎn)化學(xué)(株式)會(huì)社制備的葡萄糖，山梨醇是使用和光純藥エ業(yè)(株式)會(huì)社制備的山梨醇。另外，增殖試驗(yàn)中所使用的酵母為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型吋，在使用的YPD液體培養(yǎng)基和YPDS液體培養(yǎng)基中，均添加相當(dāng)于葡萄糖含量的0. 3質(zhì)量％以上的尿嘧啶而進(jìn)行増殖試驗(yàn)。即，對(duì)于YPD液體培養(yǎng)基或者YPDS液體培養(yǎng)基，葡萄糖含量為2質(zhì)量％時(shí)，對(duì)于YPD液體培養(yǎng)基或者YPDS液體培養(yǎng)基，尿嘧啶含量為6X 10_3質(zhì)量％以上。并且，増殖試驗(yàn)中所使用的酵母為其他營(yíng)養(yǎng)缺陷型吋，也同樣在所使用的YPD液體培養(yǎng)基和YPDS液體培養(yǎng)基中，均添加足夠的所需物質(zhì)后，進(jìn)行増殖試驗(yàn)。所述OD66tl例如可以利用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定。由于所述酵母能夠在滲透壓為300m 0sm(0SM0L，滲量)的YPD液體培養(yǎng)基中増殖，因此例如不需要為了提高培養(yǎng)基的滲透壓而添加糖等物質(zhì)，從而可以降低培養(yǎng)成本。并且，將所述酵母添加到食品吋，即使在培養(yǎng)后以低滲透壓溶液洗浄，菌體也不會(huì)被破壞，因此可以提1 活菌回收率，而且可以提1 食品制造效率。< 酵母 >對(duì)于所述酵母的種類，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以列舉面包酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、清酒酵母以及味增醬油酵母等。其中，優(yōu)選為面包酵母。作為所述酵母，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以列舉酵母(Saccharomyces)屬、接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、亞羅酵母(Yarrowia)屬、擬威爾酵母(Williopsis)屬、有孢圓酵母(Torulaspora)屬、假絲酵母(Candida)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、畢赤酵母(Pichia)屬等。作為所述酵母的種，可以列舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、措抗酵母(Candida saitoana)、熱帶假絲酵母(Candida tropical is)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)、德?tīng)柌加斜A酵母(Torulaspora deIbrueckii)、皺糟假絲酵母(Candida sake)、熱帶假絲酵母(Candidatropical is)、產(chǎn) 朊假絲酵母(Candida 11丨;[118)、異常畢赤酵母(？;[(31113311011^13)、土星擬威爾酵母(Williopsis saturnus)、扣囊復(fù)膜抱酵母(Saccharomycopsis fibIigera)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、畢赤酵母(Pichia farinosa)等。其中，優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus),而且尤其優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。作為所述釀酒酵母，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。但是優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11291、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293 以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERMBP-11294。基于免疫增強(qiáng)作用高的理由，尤其優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293 以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERMBP-11294。所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11291、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11293以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11294是由發(fā)明人們制備的菌株，并且保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專利生物保藏中心。另外，所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11291、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11293以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11294的染色體上的突變位點(diǎn)，尚未被明確證實(shí)。但是已經(jīng)明確，在所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERMBP-11294中，15號(hào)染色體的約IOOOObp的BamHI酶切片段上發(fā)生了突變。所述BamHI酶切片段中包含完整的RPS12、MRS6、GPB1、RAD17、NDD1基因，以及部分SCPl基因。因此暗示著，所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP_11294所具有的免疫增強(qiáng)作用，并不是由記載在專利公開(kāi)公報(bào)2006-75039中的MCD4基因、GASl基因以及CWH41基因的突變引起的。另外，對(duì)于所述酵母的染色體組的數(shù)目，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇，例如，可以列舉一倍體等。-培養(yǎng)方法-作為所述酵母的培養(yǎng)方法，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的從現(xiàn)有的公知的方法中適當(dāng)選擇。例如，可以列舉分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)等方法。可以優(yōu)選地利用發(fā)酵罐(jar fermenter)來(lái)進(jìn)行所述培養(yǎng)，對(duì)于此時(shí)的發(fā)酵罐中的條件，沒(méi)有特別限制，可以適當(dāng)選擇。例如，培養(yǎng)溫度約為28 33°C，培養(yǎng)時(shí)間約為f 120小時(shí)，PH值約為4 7，通氣量約為(T5vvm，而攪拌速度約為10(T700rpm。—用途一作為所述酵母的用途，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。但是優(yōu)選為作為添加到食品中而被使用的食品原材料、飼料、魚(yú)飼料等用途，尤其優(yōu)選為作為所述食品原材料的用途。另外，所述酵母可適用于例如面包、啤酒發(fā)酵等食品的制造中。通過(guò)利用本發(fā)明的酵母，可以得到具有免疫增強(qiáng)功能的食品、具有免疫增強(qiáng)功能的飼料、具有免疫增強(qiáng)功能的魚(yú)飼料。此時(shí)，所述酵母可以以菌體未被破壞的狀態(tài)直接使用，也可以以菌體被破壞的狀態(tài)使用，另外還可以以干燥狀態(tài)使用，并且還可以以活菌狀態(tài)甚至未干燥的狀態(tài)使用。作為所述破碎方法，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以選擇磨碎機(jī)(DYN0-MILL)等物理破碎 處理，也可以選擇化學(xué)破碎處理。作為所述酵母的適用對(duì)象，只要具有自然免疫，就沒(méi)有特別限制。例如，可以列舉人；除了人以外的動(dòng)物(馬、牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、原駝等家畜，小白鼠、大鼠、豚鼠、兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雞、鴨、火雞、鴕鳥(niǎo)等家禽，真鯛、條石鯛、牙鲆、比目魚(yú)、五條螄、黃獅魚(yú)、琥珀魚(yú)、金槍魚(yú)、長(zhǎng)縞鰺、香魚(yú)、鮭鱒魚(yú)類、紅鰭東方飩、鰻魚(yú)、泥鰍、鯰魚(yú)等魚(yú)類，日本囊對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、三疣梭子蟹等甲殼類，鮑魚(yú)、海螺、扇貝、牡蠣等貝類，寵物狗、寵物貓等寵物)等。<酵母的制備方法>所述酵母可以通過(guò)以下方法制備。即，可以以食品用途使用的酵母作為親株，對(duì)該親株以人工誘變的方法在染色體上引起突變。另外，也可以利用，可以以食品用途使用的酵母作為親株，在該親株中根據(jù)自然突變?cè)谌旧w上發(fā)生突變的菌體。作為所述可以以食品用途使用的親株，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以利用所述〈酵母 > 部分中列舉的酵母。所述人工誘變方法是指根據(jù)例如誘變劑、紫外線照射、放射線照射等誘變因素，而相比于自然突變，以更高頻率引起DNA突變的方法。通過(guò)利用所述人工誘變方法，在不插入親株原本具有的堿基序列以外的堿基序列的前提下，能夠在染色體上發(fā)生突變。對(duì)于所述誘變劑，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以列挙，甲基磺酸こ酯(Ethylmethane Sulfonate)、亞硝基胍、5_溴尿卩密唳等。
所述放射線例如，可以列舉X線、a線、P線、Y線、粒子束等。作為進(jìn)行人エ誘變處理后，篩選具有免疫增強(qiáng)作用的酵母的方法，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以將對(duì)選擇培養(yǎng)基的耐性、細(xì)胞表層的甘露聚糖的含量、巨噬細(xì)胞活化作用作為指標(biāo)，進(jìn)行篩選。作為根據(jù)所述人工誘變方法或者所述自然突變而發(fā)生突變的基因，只要親株能夠獲得免疫增強(qiáng)作用，就沒(méi)有特別限制。例如，可以列舉RPS12、MRS6、GPB1、RAD17、NDD1、SCP1、MCD4、GAS1、CffH41等基因。另外，除了這些基因以外的染色體上的堿基序列發(fā)生突變也是可以的。另外，作為所述突變種類，只要親株能夠獲得免疫增強(qiáng)作用，就沒(méi)有特別限制，例如，可以列舉堿基取代、添加、缺失、逆位等。(食品或飼料)

本發(fā)明的食品或飼料的特征在于，含有所述酵母。對(duì)于所述食品，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。例如，可以列舉面包、餅干、烤餅(scone)等糕點(diǎn)，醫(yī)院膳食，流質(zhì)食物，水產(chǎn)及肉類加工品，面條類，調(diào)料，啤酒及果汁等飲料，健康食品，健康飲料等。對(duì)于所述飼料，沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)適用對(duì)象適當(dāng)選擇。作為所述適用對(duì)象，沒(méi)有特別限制，例如可以列舉，在所述酵母的用途部分中列舉的適用對(duì)象。本發(fā)明的食品或飼料由于含有具有較高的免疫增強(qiáng)作用的所述酵母，因此具有較高的免疫增強(qiáng)功能。實(shí)施例以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。(實(shí)施例1)-具有免疫增強(qiáng)作用的酵母的制備-——人工誘變處理——作為用于人工誘變處理的親株，使用實(shí)用面包酵母的一倍體的T-21 (東方酵母エ業(yè)株式會(huì)社制備)的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株T-21U株。另外，所述T-21U株是通過(guò)以下方法得到的。即，通過(guò)將T-21株在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，涂于含有5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid)的培養(yǎng)基(0. 7質(zhì)量％的酵母氮源(YEAST NITROGEN BASE (DIFC0公司))、2質(zhì)量％的葡萄糖、0.1質(zhì)量％的5-氟乳清酸、
0.05質(zhì)量％的尿嘧啶、2質(zhì)量％的瓊脂)，在30°C下培養(yǎng)3天，使菌體生長(zhǎng)，由此作為自然突變的突變體被篩選出的菌株。使用含有尿嘧啶的YPD液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母膏(東方酵母エ業(yè)(株式)會(huì)社制備)，2質(zhì)量％的蛋白胨(日本制藥(株式)會(huì)社制備)，2質(zhì)量％的葡萄糖(國(guó)產(chǎn)化學(xué)(株式)會(huì)社制備)，6X 10_3的尿嘧啶(和光純藥エ業(yè)(株式)會(huì)社制備)，以下相同)，將親株過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌體分裝在2支艾本德(印pendorf)離心管中，離心分離，并集菌。棄上清液，用無(wú)菌水洗滌2次，再將菌體懸浮于0.1M (mol/L,以下相同)磷酸緩沖液(pH7. 0)中。混合30iU甲基磺酸こ酯(EMS)，在30°C下震蕩培養(yǎng)(incubate) I小吋。通過(guò)離心回收菌體，棄上清，再將菌體懸浮于200 Ul的5質(zhì)量％硫代硫酸鈉中。將懸浮液移到新的離心管中，離心回收,用200 ill的5質(zhì)量％硫代硫酸鈉洗凈兩次。再將菌體懸浮于ImL無(wú)菌水中，適度稀釋后，涂布在YPD瓊脂培養(yǎng)基上。——篩選——通過(guò)以下的一次至三次篩選，從經(jīng)過(guò)所述人工誘導(dǎo)處理的酵母群中，篩選出具有免疫增強(qiáng)作用的酵母。作為一次篩選，進(jìn)行細(xì)胞壁突變株的選擇。在含有尿嘧啶的YPD瓊脂培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母膏、2質(zhì)量％的蛋白胨、2質(zhì)量％的葡萄糖、6X 10_3的尿嘧啶、2質(zhì)量％的瓊脂)、含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養(yǎng)基(0. 2質(zhì)量％的酵母膏、0. 4質(zhì)量％的蛋白胨、0. 4質(zhì)量％的葡萄糖、1. 2X10—3的尿嘧啶、2質(zhì)量％的瓊脂)、含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的瓊脂培養(yǎng)基上涂布菌體。在30°C下培養(yǎng)3天后，選擇(I)含有尿嘧啶的YPD瓊脂培養(yǎng)基與含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養(yǎng)基比較時(shí)，在含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養(yǎng)基上增殖較為緩慢，且(2)含有尿嘧啶的1/5YPD瓊脂培養(yǎng)基與含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的瓊脂培養(yǎng)基比較時(shí)，在含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的瓊脂培養(yǎng)基上增殖較為緩慢的菌株(或者死亡的菌株)。一次篩選的結(jié)果，得到了 3120株突變體。作為二次篩選，根據(jù)用FITC標(biāo)記ConA，而進(jìn)行甘露聚糖的染色。利用牙簽刮取菌落,并懸浮于加入1. OM山梨醇的PBS溶液中。離心回收,再懸浮于加入1. OM山梨醇的PBS溶液之后，混合到用FITC標(biāo)記的ConA溶液(Sigma公司)中，在室溫下遮光放置30分鐘。洗凈I次，利用熒光顯微鏡在藍(lán)色激發(fā)光下觀察菌體。由此，選擇當(dāng)整體觀察時(shí)幾乎看不到熒光的菌株，或者從照片上不能確認(rèn)熒光的菌株。所述二次篩選的結(jié)果，從3120株選擇了 4株(突變體廣4)。圖1為突變體廣4的顯微鏡圖像，上面的是光學(xué)顯微鏡圖像，下面的是在甘露聚糖染色后觀察的熒光顯微鏡圖像。圖1中，突變體廣4幾乎觀察不到熒光，尤其突變體2 4完全觀察不到熒光。另タ卜，突變體I 為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11291,突變體2為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11292,突變體3為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293,突變體 4 為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11294。這些4株突變體均保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專利生物保減中心。作為三次篩選，檢測(cè)突變體廣4的巨噬細(xì)胞的活化作用。將突變體廣4離心集菌，用こ醇處理后，用無(wú)菌水洗凈2次。進(jìn)ー步用RPM1-1640培養(yǎng)基洗浄一次后，再懸浮于RPM1-1640培養(yǎng)基中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)。將酵母濃度調(diào)整到規(guī)定量，并作為樣品。巨噬細(xì)胞使用自培養(yǎng)第2天的細(xì)胞。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞從培養(yǎng)燒瓶中回收，用新的培養(yǎng)基洗滌2次，再用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將巨噬細(xì)胞的細(xì)胞濃度調(diào)整到規(guī)定量，并作為待檢測(cè)活性的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液。將所述巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液分裝在24孔板中，并混合所述樣品，使酵母與巨噬細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比值成為30:1。將混合液在37 °C，5%CO2下培養(yǎng)6小時(shí)之后，用滴管取培養(yǎng)液，并離心。回收上清液，利用小鼠腫瘤壞死因子免疫檢測(cè)試劑盒(Quantikine MouseTNF-a Immunoassay (R&D systems公司))檢測(cè)上清液中含有的TNF-a蛋白質(zhì)量。作為對(duì)巨曬細(xì)胞的活化作用的陽(yáng)性對(duì)照，使用內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide(LPS, Wako公司))。圖2為示出關(guān)于突變體f 4的巨噬細(xì)胞活化作用試驗(yàn)的結(jié)果的圖。在圖2中表現(xiàn)出突變體3、4相比于親株具有非常強(qiáng)的巨噬細(xì)胞活化作用(免疫增強(qiáng)作用)。經(jīng)過(guò)三次篩選的結(jié)果，從突變體廣4的4株中選擇了 2株(突變體3、4)。(實(shí)施例2)一低滲透壓培養(yǎng)基中的増殖試驗(yàn)ー將實(shí)施例1中的突變體3作為樣品使用，并且根據(jù)以下試驗(yàn)方法進(jìn)行在低滲透壓培養(yǎng)基中的増殖作用的試驗(yàn)。首先，將突變體3在含有尿嘧啶的YPDS液體培養(yǎng)基(I質(zhì)量％的酵母膏(東方酵母エ業(yè)(株式)會(huì)社制備)、2質(zhì)量％的蛋白胨(日本制藥(株式)會(huì)社制備)、2質(zhì)量％的葡萄糖(國(guó)產(chǎn)化學(xué)(株式)會(huì)社制備)、5.5質(zhì)量％ (0.3M)的山梨醇(和光純藥エ業(yè)(株式)會(huì)社制備)，以下相同)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)后的一部分培養(yǎng)液接種到含有尿嘧啶的YPD液體培養(yǎng)基以及含有尿嘧啶的YPDS液體培養(yǎng)基中，使OD66tl達(dá)0. 1，然后在30°C下振蕩培養(yǎng)。并且，利用分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)中的培養(yǎng)基的0D_，由此評(píng)價(jià)菌體數(shù)量隨時(shí)間的變化(増殖)。并且，作為對(duì)照，使用親株和專利公開(kāi)公報(bào)2006-75039號(hào)中記載的根據(jù)基因重組技術(shù)制備的變異體(MCD4A )，并根據(jù)與突變體3相同的方法培養(yǎng)，評(píng)價(jià)菌體數(shù)量隨時(shí)間的變化(増殖)。

圖3A及圖3B為示出關(guān)于突變體3和親株的增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖，圖4為示出記載在專利公開(kāi)公報(bào)2006-75039中的變異體(MCD4A株)的增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖。從3A及圖3B的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的酵母(突變體3)在低滲透壓的含有尿嘧啶的YPD液體培養(yǎng)基以及在調(diào)整過(guò)滲透壓的含有尿嘧啶的YPDS液體培養(yǎng)基中均能夠與親株近乎相同地増殖。另外，從圖4的結(jié)果可以看出，專利公開(kāi)公報(bào)2006-75039號(hào)中記載的根據(jù)基因重組技術(shù)制備的變異體(MCD4 A )，雖然在調(diào)整過(guò)滲透壓的含有尿嘧啶的YPDS液體培養(yǎng)基中較為快速増殖，但是在低滲透壓的含有尿嘧啶的YPD液體培養(yǎng)基中增殖極其緩慢。(實(shí)施例3)-壓榨鮮酵母的制備-使用實(shí)施例1中得到的突變體3而制備壓榨鮮酵母。將在含有尿嘧啶的YMPD液體培養(yǎng)基(0. 3質(zhì)量％的酵母膏、0. 3質(zhì)量％的麥芽膏、
0.5質(zhì)量％的蛋白胨、3質(zhì)量％的葡萄糖、9X 10_3質(zhì)量％的尿嘧啶)中培養(yǎng)的突變體3為種子酵母，進(jìn)行流加培養(yǎng)。連續(xù)流加糖溶液(相當(dāng)于添加糖濃度260g/L、尿素19. 49g/L、KH2PO4 52g/L的溶液)而進(jìn)行培養(yǎng)。流加方法按照常規(guī)的方法進(jìn)行。培養(yǎng)結(jié)束后，分離、水洗、過(guò)濾培養(yǎng)發(fā)酵液(broth)而得到壓榨鮮酵母。(實(shí)施例4)一發(fā)酵カ試驗(yàn)ー將實(shí)施例3的壓榨鮮酵母作為樣品使用，并根據(jù)以下的試驗(yàn)方法對(duì)壓榨鮮酵母的發(fā)酵カ的進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)酵母エ業(yè)會(huì)制定的酵母發(fā)酵カ測(cè)定方法，檢測(cè)120分鐘的氣體發(fā)生量。結(jié)果表不在表Io[表I]1: 親株 I突變體權(quán)利要求
1.ー種酵母，其特征在于，能夠在滲透壓為300m Osm的YPD液體培養(yǎng)基中增殖； 所述增殖是指，將YPDS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的一部分培養(yǎng)液向所述YH)液體培養(yǎng)基中添カロ，以使OD66tl達(dá)到0. 1，在30°C條件下培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)24小時(shí)后的OD66tl達(dá)到1. 0以上， 細(xì)胞壁甘露聚糖少， 具有巨噬細(xì)胞活化作用， 該酵母是 Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11294。
2.如權(quán)利要求1所述的酵母，其特征在于，未被基因重組。
3.含有如權(quán)利要求1至2中任意一項(xiàng)所述的酵母的食品或者飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有免疫增強(qiáng)作用的酵母及含有該酵母的食品或飼料。目的在于提供具有良好的安全性、即使直接攝取菌體也能起到較高的免疫增強(qiáng)作用、便宜且容易購(gòu)得、食品制造中可以直接利用、并且在低滲透壓下也能夠培養(yǎng)的酵母，以及含有該酵母的食品。酵母的特征在于，細(xì)胞壁甘露聚糖少，具有免疫增強(qiáng)作用，能夠在滲透壓為300m Osm的YPD液體培養(yǎng)基中增殖。所述酵母優(yōu)選為Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11293以及Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11294中的任意一種。
文檔編號(hào)C12R1/865GK103060214SQ20121057994
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日
發(fā)明者東雅之, 立花太郎, 古川周平, 中島亮一, 渡邊肇, 小林紗由美 申請(qǐng)人:東方酵母工業(yè)株式會(huì)社, 東雅之