專利名稱：一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的產酸克雷伯氏菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產酸克雷伯氏菌及其應用，特別是一種能合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的產酸克雷伯氏菌及其應用。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate, EC)，在醫學上有重要用途，曾一度被用作治療多發性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作為麻醉劑使用。近年研究發現，氨基甲酸乙酯是一種人類潛在致癌物質，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，國際癌癥研究機構在2007年把氨基甲酸乙酯列為2A類致癌物。氨基甲酸乙酯是一種伴隨發酵食品(如酒精飲料、豆醬、醬油等)的生產過程中產生的副產物，對食品安全和生物體健康都有著嚴重的影響和危害。面對氨基甲酸乙酯所造成的食品安全問題，以微生物及酶降解實現食品中氨基甲酸乙酯的無危害化，是較理想的解決方案。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) SC07,已于2012年10月19日保藏于中國典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012415。菌落為白色圓形，表面濕潤光滑，邊緣規則，半透明或不透明，菌落大小1.5-2.5_。好氧或兼性厭氧。菌體革蘭氏陰性，有莢膜，1000X顯微鏡下觀察細胞呈長桿狀或串珠狀。見附圖1。所述產酸克雷伯氏菌分離自成年雌性小鼠腸道，其保藏條件如下從生長良好的平板上挑取單菌落轉接入營養肉湯培養基中，在30°C，200rpm，培養16h，取500 u L培養液移入含有500 u L40%甘油的保藏管中，置于_80°C冰箱保存。上述的營養肉湯培養基為二型營養肉湯培養基，配方為蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,氯化鈉5g，蒸餾水1L，如需固體培養基，再添加2%瓊脂。本發明的另一個目的是提供上述產酸克雷伯氏菌粗酶液的提取方法。本發明的另一個目的是提供上述產酸克雷伯氏菌的應用，其合成的酸性氨基甲酸乙酯水解酶可以在PH小于5的條件下快速分解發酵食品中的副產物氨基甲酸乙酯并產生乙醇和氨氣。其在最適PH7. 0時酶活為12. 3U/g，在pH5. 0時的酶活為2. 6U/g。本發明的另一個目的是提供上述產酸克雷伯氏菌在酸性環境下分解尿素的應用，其合成的酸性脲酶可以在PH小于5的條件下快速分解發酵食品中的副產物尿素并產生二氧化碳和氨氣其脲酶酶活為25. 4U/g，并提供脲酶活性的檢測方法。本發明提供的產酸克雷伯氏菌能合成氨基甲酸乙酯水解酶以及脲酶，在pH為7. 0時具有最高酶活，能在酸性條件下快速分解氨基甲酸乙酯以及尿素。在PH為5. 0的條件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活為2.6U/g，脲酶酶活為25.4U/g。在pH為7.0時，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活為12. 3U/g。


圖1產酸克雷伯氏菌顯微照片圖2pH對產酸克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響
具體實施例方式實施例1:產酸克雷伯氏菌篩選方法將25g每只5周大雌性昆明小鼠進行五天的強飼氨基甲酸乙酯溶液(200mg/kgbody weight/day)后解剖，并用濃度為0. 9%的生理 鹽水沖洗小鼠胃腸道組織，取組織懸浮液ImL于IOOOXg下離心IOmin,取上清液接種于富集培養基中(牛肉浸膏IOg,蛋白胨IOg,NaC15g,氨基甲酸乙酯IOgJjC lOOOmL，pH7. 0)，30°C下通氣培養20h。培養液于2000Xg離心5分鐘，取上清涂布于篩選培養基(牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，瓊脂20g，水lOOOmL，pH5. 0)中培養三天。挑選菌落形態較大的菌株轉移到營養肉湯培養基中培養20h后進行保藏。挑取_80°C保藏的菌株在營養肉湯瓊脂固體培養基上劃線，于37°C培養24h后,挑取單菌落接種于營養肉湯液體培養基中，37°C在轉速為200rpm的搖床培養24h,離心5min(12000rpm, 4°C )后收集菌體，再用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液重懸浮菌體至0. lg/mL。通過超聲破碎進行酶粗提液的提取，對粗酶液進行氨基甲酸乙酯水解酶酶活測定檢測到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶的活性的菌株，通過16S rDNA序列分析可知該菌株為一株產酸克雷伯氏菌，已于2012年10月19日保藏于中國典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCCNO:M2012415,保藏地址為中國武漢武漢大學。實施例2 :產酸克雷伯氏菌中氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法挑取_80°C保藏的菌株在營養肉湯瓊脂固體培養基上劃線,于37°C培養24h后,挑取單菌落接種于營養肉湯液體培養基中，37°C在轉速為200rpm的搖床培養24h，收集菌液50mL于冷凍高速離心機中低溫離心IOmin (IOOOOrpm, 4°C )后收集菌體，菌體沉淀中加入相同菌液體積的50mM PBS或50mM Tris-HCl (緩沖液pH應根據所篩選的蛋白穩定范圍選取)重懸洗滌三次。再用PH7. 0的PBS緩沖液懸浮菌體至0. lg/mL。將菌液在_80°C冰凍，室溫融解，反復凍融三次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。將反復凍融的菌液，置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲條件25W，工作2S，間隔2S，重復工作lOmin，直至菌體溶液變清澈為止，大約花費時間20min。將菌體超聲破碎后于低溫離心機中離心IOmin (IOOOOrpm, 4°C ),將上清液轉移到干凈的Eppendorf管中，低溫保存。實施例3 :氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的酶活檢測方法氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液酶活檢測方法的原理是利用在一定條件下，氨基甲酸乙酯降解酶科將氨基甲酸乙酯分解生成乙醇，氨氣和二氧化碳。氨與苯酚-次氯酸鈉反應形成靛酚藍顯藍色，用分光光度計在630nm處測其吸光值，分析氨的生成量，從而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。酶活測定試劑的配制顯色劑1:稱取15g苯酚和0. 625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL
顯色劑I1:稱取13. 125g氫氧化鈉和7. 5mL次氯酸鈉用超純水定容至250mL終止劑稱取IOg三氯乙酸用超純水定容至IOOmLNH4+標準溶液制備lmL氨水溶于超純水中并定容至145mL，配成0. lmol/L的NH4+溶液，并以此為母液，用超純水將之稀釋并配制成0.1mmol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L、0. 4mmol/L、0. 5mmol/L 的 NH4+ 標準溶液。氨離子標準曲線的繪制分別精確移取ImL NH4+標準梯度液置于順序編號的IOmL比色管中。37°C下恒溫保溫15min，立即吸取ImL終止劑于比色管中，振蕩混勻。再依次加A ImL顯色劑I和顯色劑II，強烈振蕩，使之充分混勻，反應20min。超純水定容至10mL，在630nm下比色測定OD值，以OD值為縱坐標，NH4+梯度為橫坐標作圖，得到標準曲線。酶活的測定取兩支IOmL比色管,分別加入ImL酶液和超純水。然后在兩管中分別加入ImL超純水，在37°C恒溫水浴箱中反應15min后，在兩管各加入ImL三氯乙酸終止劑，混勻后加入ImL的顯色劑I和ImL顯色劑II，強烈震蕩，繼續在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10mL,630nm處比色,并記錄OD值。酶活計算公式酶活力=A OD630 XnXkX 10/15式中A OD630 :酶反應后樣品測定與空白試驗光密度值之差n :酶活測定液稀釋倍數k:標準曲線斜率的倒數10 =ImL樣品液稀釋至IOmL的倍數15 :酶反應的時間(min)(酶反應的時間為15min)5.酶活定義酶活力定義在常壓、37°C條件下每分鐘分解底物產生I U mol氨為一個酶活力單位。實施例4 :氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液最適pH的確定按下表配置緩沖溶液，其溶液pH值以酸度計測定值為準。
權利要求
1.一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的產酸克雷伯氏菌SC07(Klebsiella oxytocaSC07)，于2012年10月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012415。
2.權利要求1所述產酸克雷伯氏菌，其特征是能耐受3%(w/v)氨基甲酸乙酯。
3.權利要求1所述產酸克雷伯氏菌，其能夠合成氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶。
4.權利要求1-3任一所述的產酸克雷伯氏菌應用于氨基甲酸乙酯水解酶的生產。
5.權利要求1-3任一所述的產酸克雷伯氏菌應用于氨基甲酸乙酯的降解。
全文摘要
本發明公開了一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)SC07，已于2012年10月19日保藏于中國典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CCTCC NO:M2012415。該產酸克雷伯氏菌SC07能夠在酸性環境下快速降解氨基甲酸乙酯和尿素，對發酵食品中氨基甲酸乙酯的消除起到了積極的作用，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102994433SQ20121058176
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者陳堅, 堵國成, 方芳, 張繼冉 申請人:江南大學