一種獲得自身反應性b細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得自身反應性B細胞的方法，本發明所述的方法材料包括生物素鉸鏈的dsDNA和鏈親和素化的免疫磁珠。利用本發明所述的dsDNA免疫磁珠方法分選系統性紅斑狼瘡小鼠模型和病人的自身反應性B細胞，結果顯示本發明所述的方法能夠有效地分選出高純度的自身反應性B細胞。高純度的自身反應性B細胞對自身抗原dsDNA的刺激能快速增殖并有效地產生自身抗體。本發明所述的方法有效地從系統性紅斑狼瘡小鼠模型和病人體內獲得了高純度的自身反應性B細胞。這為研究體內稀少的自身反應性B細胞的特性和將來自身反應性B細胞的應用建立細胞分選平臺。
【專利說明】一種獲得自身反應性B細胞的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，涉及一種從自身免疫性疾病中獲得自身反應性B細胞 的方法。具體而言，本發明所述的方法材料包括生物素鉸鏈的dsDNA和鏈親和素化的免疫 磁珠，應用dsDNA免疫磁珠（生物素鉸鏈的dsDNA和鏈親和素化的免疫磁珠聯用）方法所分 選的自身反應性B細胞體外實驗表明所述分選方法能有效分選出高純度的反應性B細胞。

【背景技術】
[0002] 隨著我國社會經濟的發展，自身免疫病的發病率日益上升，而且自身免疫病后期 對人們生產、生活乃至生命健康造成的危害是非常嚴重的。加強該領域的基礎性研究將會 進一步了解自身免疫性疾病的發生、發展、轉歸，進而提高對它的診斷、治療和預防。這對保 障人類健康生活，促進經濟社會的發展均有著重要的理論及現實意義。
[0003] 自身免疫性疾病根據組織損傷機制分為兩大類：一類是T細胞介導的自身免疫性 疾病如多發硬化（MS)，另一類是自身抗體通過結合組織表面的抗原或與可溶性抗原形成免 疫復合物而介導的自身免疫性疾病。自身抗體相關的疾病如系統性紅斑狼瘡（SLE)、重癥 肌無力（MG)和sjogren氏綜合癥等由于自身抗原特異性B細胞耐受缺失而造成的。在自 身抗體如IgG相關的眾多的疾病中，輔助性T細胞可促進自身反應性B細胞的反應。近來， 許多證據顯示，在T細胞驅動的自身免疫紊亂疾病如多發性硬化癥、I型糖尿病中，自身反 應性B細胞也有著不可忽視的作用。因此，現在清楚眾多自身免疫紊亂是由自身反應性T、 B細胞協調和共同介導的。
[0004] 為了研究自身反應性T細胞，人們利用自身反應性T細胞的特性來使用四聚體 (tetramer)技術分選。四聚體（tetramer)技術是一種可直接對抗原特異性T細胞（antigen specific T cells, AST)進行標記和檢測的方法。該技術利用1個分子的鏈霉親合素與4 個分子的生物素化主要組織相容性復合體（major histocompatibility comples，MHC)_抗 原肽單聚體連接成四聚體復合物，顯著增加了其與T細胞受體（T-cell receptor, TCR)的 親和力，因而使AST的測定敏感性大為提高，被諾貝爾獎獲得者Doherty教授稱之為定量 檢測AST的金標準（包括抗原特異性效應T細胞和記憶性T細胞）[Altman JD，Moss PAH， Goulder PJR，et al. Science, 1996, 274:94]。除此之外，四聚體技術結合細胞表面標志分 子、細胞內效應分子染色（如各種細胞因子、趨化因子和細胞毒素），以及通過對四聚體陽 性T細胞的進一步分選等，可實現對AST活化增殖、凋亡老化及功能的評估，為闡明特定AST 在疾病發生、發展及防治中的作用提供重要的研究手段[Bodinier M，Peyrat MA，Tournay C，et al. Nature Med 2000,6 :707. ]。MHC-肽與 TCR 作用的分子基礎 MHC-肽與 TCR 作用的 分子基礎是基于T細胞膜上表位特異性TCR對抗原呈遞細胞（APC)、靶細胞表面并與MHC分 子結合成復合物[Romero P，Dunbar PR，Valmori D，et al.J Exp Med，1998,188:1641·]。
[0005] 然而，對于自身反應性B細胞沒有很好的分選方法，這極大的限制對自身反應性B 細胞的基礎研究和臨床應用。為了開展對自身反應性B細胞的基礎研究，現在一般使用某 個自身反應性B細胞的轉基因小鼠 [Pasquali JL，Soulas_Sprauel P，Korganow AS，Martin T, Auto-reactive Β cells in transgenic mice. J Autoimmun. 2007. 29 :250-256. ]〇 抗 dsDNA抗體的自身反應性B細胞特異地在SLE病人體內存在，而在正常健康人體中則檢測 不至lj [Erikson J, Radic MZ, Camper SA, Hardy RR, Carmack C, ffeigert M. Expression of anti-DNA immunoglobulin transgenes in non-autoimmune mice. Nature 1991. 349 ： 331-344.]。多種針對dsDNA自身反應性B細胞轉基因小鼠被建立來研究抗dsDNA抗 體的自身反應性B細胞的特性，發育等[Xu H，Li H，Suri-Payer E，Hardy RR，Weigert M. Regulation of anti-DNA B cells in recombination-activating gene-deficient mice. J Exp Med. 1998,188 :1247-54.]。盡管，通過對自身反應性B細胞轉基因小鼠的研究 獲得了大量的有關自身反應性B細胞的知識。然而，仍然不能很好地分選自身反應性B細 胞，進而，限制對自身反應性B細胞的臨床應用，如分選人自身反應性B細胞通過體外誘導 產生調節性B細胞然后回輸調節性B細胞進行治療自身免疫性疾病的研究。


【發明內容】

[0006] 為解決分選自身反應性B細胞的技術難題，本發明公開了一種分選自身反應性B 的方法--dsDNA免疫磁珠法，所述方法材料包括生物素鉸鏈的dsDNA和鏈親和素化的免 疫磁珠。
[0007] 本發明通過上述dsDNA免疫磁珠（生物素鉸鏈的dsDNA和鏈親和素化的免疫磁珠 聯用）分選自身反應性B細胞，具體包括以下步驟：
[0008] 1)寡DNA片段通過3'末端標記生物素
[0009] 獲得胎牛胸腺，通過研磨獲得細胞懸液，應用Trizol方法獲得全基因組DNA。全基 因組DNA通過超聲破碎獲得寡脫氧核糖核酸。最后通過argrose分選出100pb-1000bp的 寡脫氧核糖核酸。
[0010] DNA探針的生物素標記反應體系為：
[0011]

【權利要求】
1. 一種自身反應性B細胞的分選方法，其特征在于，所述分選材料包括生物素鉸鏈的 dsDNA和鏈親和素化的免疫磁珠。
2. 權利要求1所述的自身反應性B細胞的分選方法，其特征在于，所述的生物素鉸鏈的 dsDNA為DNA通過3'端與生物素鉸鏈。
3. 權利要求1所述的自身反應性B細胞的分選方法，其特征在于，所述的dsDNA為大小 不同的寡脫氧核糖核酸。
4. 權利要求1所述的自身反應性B細胞的分選方法，其特征在于，所述的鏈親和素化的 免疫磁珠為鏈親和素共價鍵鉸鏈的免疫磁珠。
5. 權利要求1-4中任意一項所述的細胞分選材料，其特征在于，生物素鉸鏈的dsDNA和 鏈親和素化的免疫磁珠質量體積比（μ g/ul)為0. 5?10 : 1。
6. 權利要求1-4中任意一項所述的細胞分選材料，其特征在于，生物素鉸鏈的dsDNA和 鏈親和素化的免疫磁珠的質量比為1 : 4。
7. 權利要求3所述的細胞分選材料，其特征在于，所述的大小不同的寡脫氧核糖核酸 為 100pb-1000pb dsDNA。
8. 權利要求1-4所述的細胞分選材料，其特征在于，所述的大小不同的寡脫氧核糖核 酸為100pb-1000pb dsDNA還包括其它的抗原分子如ssDNA等。
9. 權利要求1-4中任意一項所述的細胞分選材料，在分選自身免疫性疾病中自身反應 性B細胞的應用。
10. 權利要求8所述的自身免疫性疾病，其特征在于，所述的自身免疫性疾病為自身抗 體相關的免疫性疾病，包括系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力、干燥綜合癥。
11. 權利要求1-4中任意一項所述的自身免疫性B細胞分選方法，其特征在于，所述分 選方法所分選出的自身免疫性B的臨床應用。
【文檔編號】C12Q1/04GK104232577SQ201310244248
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月20日 優先權日:2013年6月20日
【發明者】王仁喜, 黎燕, 肖鶴, 韓根成, 陳國江, 侯春梅, 沈倍奮, 馬寧, 邢陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所