兩步催化制備(r)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于：其以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）為底物，在同一個反應體系，利用生物催化劑，通過兩步催化反應，在水相緩沖液中反應制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，過程中不需對中間產物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯提取純化。本發明反應步驟簡單、成本較低、減少了有機溶劑和劇毒品的使用量，是一種綠色生產方法。
【專利說明】兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種兩步生物催化耦聯制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法。

【背景技術】
[0002]他汀類藥物是目前世界上最暢銷的藥物大類，它對膽固醇合成的關鍵限速酶3-羥基-3-甲基輔酶A (HMG-CoA)還原酶具有強烈的抑制作用，可抑制膽固醇的合成，是治療心血管疾病的重要藥物。其中最有代表性的是阿托伐他汀(Atorvastatin)和羅素伐他汀(Rosuvastatin)，前者是世界上首款銷售額突破百億美金的藥物，而后者則是迄今為止降脂效果最好的他汀類藥物，又被成為“超級他汀”。最近又有大量的臨床研究結果表明:他汀類藥物除了是最有效的降低膽固醇的藥物，而且對骨質疏松癥、老年癡呆癥、心臟病和糖尿病等各種疾病都有顯著療效，如果進一步開發新適應癥，他汀類藥物無疑將會有更大的的臨床應用范圍。作為他汀類藥物的關鍵手性中間體的(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，市場的需求量會越來越大。
[0003](R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯可以通過化學法或生物法加以制備。目前國內主要通過化學法生產，化學法的反應條件苛刻，成本高，純度低，污染尤其嚴重，對環境的影響非常大。相比較而言，生物法的反應條件溫和，更加實用和環保。目前研究主要是利用(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，在鹵醇脫鹵酶的作用下脫鹵加氰基得到(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。國內專利CN 101760468公開了利用突變到的鹵醇脫鹵酶催化生產(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，但酶活較低，催化效率低，成本高，不利于大規模工業化生產。在國內專利CN 103014082公開制備(R) _4_氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法中，添加凍干酶粉，在水相體系中通過補加20%稀硫酸和30%的NaCN溶液控制反應體系的pH，催化劑的成本較高，無法進行大規模產業化應用，而且補入的NaCN溶液嚴重過量，NaCN是劇毒品，給后提取和操作環境安全隱患，不利于綠色環保的要求。
[0004]同時，由于所用底物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯也是由生物法獲得，一般是先提取得到純品的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，再進行下一步反應，目前也尚無不經純化中間產物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，直接進行下一步反應的報道。


【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種兩步法催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，該方法反應步驟簡單、成本較低、減少了有機溶劑和劇毒品的使用量，是一種綠色生產方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案如下:兩步催化制備(R)_4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:其以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)為底物，在同一個反應體系，利用生物催化劑，通過兩步催化反應，在水相緩沖液中反應制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，過程中不需對中間產物(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯提取純化。
[0007]所述的兩步催化反應為，第一步，4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)在含有重組酮還原酶KREDl基因的大腸桿菌細胞的催化下生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，第二步
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯在含有鹵醇脫鹵酶HHDH的大腸桿菌的催化下生成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。整個過程在同一個水相體系中進行，第一步反應結束后不需對中間產物(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯提取純化直接進行第二步反應。
[0008]所述的含有重組酮還原酶KREDl基因的大腸桿菌細胞的制備方法為:將含有酮還原酶KREDl基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至0D_值達到0.8?1.2時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌全細胞。
[0009]所述的含有鹵醇脫鹵酶HHDH的大腸桿菌的制備方法為:將含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至0D600值達到0.8?1.2時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用2?8倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞，細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘，4°C下15000g離心30min，上清液即得鹵醇脫鹵酶HHDH液。
[0010]進一步地，所述第一步反應起始時的反應體系中，底物COBE的濃度總體為10%?30% (w/v)，包括后續分批加入的；重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌細胞的用量為底物質量的0.5%?8.0% (w/w),異丙醇的濃度為3%?15% (w/v),所述不對稱還原反應在pH為
6.0?8.0的50mM的水相磷酸鹽緩沖液中進行，反應體系的溫度為30°C。根據一個優選方面，反應起始時的反應體系中，底物COBE的濃度為20%?25% (w/v)，反應中無需添加輔酶因子。
[0011]進一步地，在第一步反應體系中加入的Ca2+、Mg2+等二價金屬離子，濃度為0.5-20mM，不僅可以增加大腸桿菌細胞的通透性，而且這些離子還是酮還原酶KREDl的增強劑。其中更優選Ca2+，根據一個具體方面，所述的反應體系中所用的為CaCl2。
[0012]進一步地，第一步反應結束后，加入pH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液，然后在真空度
0.05 MPa的條件下把溫度升至50°C后保持lOmin，加入鹵醇脫鹵酶HHDH液開始第二步反應。其中pH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液是通過往30%氰化鈉加磷酸調節pH至7.0。
[0013]進一步地，第二步反應起始時的反應體系中，加入NaCN的終濃度為2%?6% (w/V)，鹵醇脫鹵酶HHDH液的用量為反應總體積的0.5 %?4.0 % (w/v)，反應體系的溫度為45 ?50°C。
[0014]進一步地，第二步反應過程中用30%的NaCN溶液控制體系的pH至6.8?7.3。
[0015]根據本發明的一個具體方面，所述制備方法的實施過程如下:在反應容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)、異丙醇、CaCl2、重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌全細胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應，利用氣相色譜方法(GC)檢測反應進程，至轉化率達到80%?100%，分批加入底物COBE。繼續進行反應，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入pH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液，然后在真空度0.05MPa的條件下把溫度升至50°C后保持lOmin，加入鹵醇脫鹵酶HHDH液開始第二步反應，反應過程中用30%的NaCN溶液控制體系的pH至6.8?7.3。利用氣相色譜方法(GC)檢測反應進程，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。
[0016]進一步地，底物COBE根據反應情況分I?3批加入，每次加入的濃度200?800mM。可有效避免高濃度的底物COBE影響其轉化率和產物的立體選擇性。
[0017]根據本發明，所用的底物COBE及其它使用到的原料均可商購獲得。此外，本發明中所述的鹵醇脫鹵酶HHDH基因已公知，可通過市售途徑獲得，，所述的酮還原酶KREDl基因序列及其制備方法參見本公司申請號為201310345823.3的發明專利。它人在實施本發明方法時可以按照本發明所述方法制備或購買。
[0018]由于以上技術方案的實施，本發明與已有技術相比具有如下優勢:本發明方法通過兩步催化反應，采用特定的重組酮還原酶KREDl和鹵醇脫鹵酶，解決了傳統生物法中催化效率低以及成本高的問題；由于第二步反應開始前通過磷酸調節pH,使整個反應體系具備一定的PH緩沖能力，減少了 NaCN的加入量。該方法反應，無需提出中間體即可進行下一步反應，無需添加有機溶劑和還原性輔因子、條件溫和、反應效率高、成本低、操作簡便，特別是，兩步反應共用同一個反應體系，節省物料提取溶劑和動力能源的消耗，有效地節省了成本，具有十分廣闊的工業化生產前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1兩步法催化制備(R)_4-氰基-3-羥基丁酸乙酯路線圖。

【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施例。
[0021]實施例1含有酮還原酶KREDl基因的重組大腸桿菌的制備方法
從轉化平板將含有酮還原酶KREDl基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養7小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養，培養至0D_值達到
1.0時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至終濃度ImM，于28°C下繼續培養20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌全細胞。
[0022]實施例2
從轉化平板將含有酮還原酶KREDl基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養，培養至0D_值達到
0.8時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至終濃度ImM，于22°C下繼續培養20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌全細胞。
[0023]實施例3
從轉化平板將含有酮還原酶KREDl基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養4小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養，培養至0D_值達到
1.2時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至終濃度ImM，于32°C下繼續培養16小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌全細胞。
[0024]實施例4含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的重組大腸桿菌的制備方法
將含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養7小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養，培養至0D_值達到1.0時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于28°C下繼續培養20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用3倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10分鐘。4°C下15000g離心30min，上清液即得鹵醇脫鹵酶HHDH液。
[0025]實施例5
將含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養，培養至0D_值達到0.8時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于22°C下繼續培養20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用2倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎30分鐘。4°C下15000g離心30min，上清液即得鹵醇脫鹵酶HHDH液。
[0026]實施例6
將含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養4小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養，培養至0D_值達到1.2時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于32°C下繼續培養16小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用8倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10分鐘。4°C下15000g離心30min，上清液即得鹵醇脫鹵酶HHDH液。
[0027]實施例7
在10mL三口燒瓶中依次加入0.28g KH2PO4,0.31g K2HPO4.3H20，32mL去離子水，形成pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，然后依次加入5.0g異丙醇，6.5g底物COBE, 1.0g實施例1制備的重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌細胞，0.028g無水CaCl2, 30 °C下磁力攪拌開始計時反應，4h取樣，GC分析監測轉化率98.5%，再加入6.5g底物COBE繼續反應，1h取樣，GC分析監測轉化率99.2%，加入pH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液10.0ml，然后在真空度0.05 MPa的條件下把溫度升至50°C后保持lOmin，加入實施例2制備的鹵醇脫鹵酶HHDH液1.2g開始第二步反應，反應過程中用30%的NaCN溶液控制體系的pH至7.0。GC分析監測反應進程，反應18h取樣，轉化率98.2%，結束反應，加入等體積乙酸乙酯多次萃取2次，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯10.6g，產物的純度為98.7%，光學ee為99.8%。其中產物的具體分析條件為:色譜柱為0.3mm毛細管柱30m(DIKMA)，FID檢測器。色譜柱溫度208 °C，氣化和檢測溫度均為230 °C，載氣流量20-30ml/min，進樣量0.3-0.5 μ L，載氣為N2。產物ee值的分析條件為:色譜柱為CP-Chirasil-DEX CB手性毛細管柱，其余條件同上。
[0028] 實施例8
在1L的反應器中依次加入28g KH2PO4, 31g K2HPO4.3H20, 3.2L去離子水，形成pH為
7.0的磷酸鹽緩沖液，然后依次加入500g異丙醇，630g底物COBE，IlOg實施例1制備的重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌細胞，2.8g無水CaCl2, 30 °C下磁力攪拌開始計時反應，4h取樣，GC分析監測轉化率98.3%，再加入630g底物COBE繼續反應，12h取樣，GC分析監測轉化率98.7%，加入實施例2制備的pH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液1.0L,然后在真空度0.05MPa的條件下把溫度升至50°C后保持lOmin，加入鹵醇脫鹵酶HHDH液115g開始第二步反應，反應過程中用30%的NaCN溶液控制體系的pH至7.0。GC分析監測反應進程，反應20h取樣，轉化率98.5%，結束反應，加入等體積乙酸乙酯多次萃取2次，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯1106g，產物的純度為98.5%，光學ee為99.8%。
【權利要求】
1.兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:其以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，在同一個反應體系，利用生物催化劑，通過兩步催化反應，在水相緩沖液中反應制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，過程中不需對中間產物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯提取純化。
2.根據權利要求1所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述的兩步催化反應為，第一步，4-氯乙酰乙酸乙酯在含有重組酮還原酶KREDl基因的大腸桿菌細胞的催化下生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，第二步(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯在含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的大腸桿菌的催化下生成(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。
3.根據權利要求2所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述的含有重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌細胞的制備方法為:將含有重組酮還原酶KREDl基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至OD6tltl值達到0.8?1.2時，加入誘導劑，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶KREDl的大腸桿菌全細胞。
4.根據權利要求2所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述的含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的大腸桿菌的制備方法為:將含有鹵醇脫鹵酶HHDH基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至0D600值達到0.8?1.2時，力口入誘導劑，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用2?8倍體積的2mM，pH7.0的三乙醇胺緩沖液懸浮細胞，細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘，4°C下15000g離心30min，上清液即得鹵醇脫鹵酶HHDH液。
5.根據權利要求2所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:所述第一步反應起始時的反應體系中，底物4-氯乙酰乙酸乙酯的濃度為10%?30%(w/v)，重組酮還原酶KREDl基因的大腸桿菌細胞的用量為底物質量的0.5%?8.0% (w/w),異丙醇的濃度為總反應體系的3%?15% (w/v),所述不對稱還原反應在pH為6.0?8.0的50mM的水相磷酸鹽緩沖液中進行，反應體系的溫度為30°C。
6.根據權利要求2所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:在第一步反應體系中加入的Ca2+、Mg2+等二價金屬離子，濃度為0.5-20mM。
7.根據權利要求2所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:第一步反應結束后，加入PH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液，然后在真空度0.05 MPa的條件下把溫度升至50°C后保持lOmin，加入鹵醇脫鹵酶HHDH液開始第二步反應。
8.根據權利要求7所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于:第二步反應起始時的反應體系中，加入氰化鈉磷酸溶液的終濃度為2%?6% (w/v)；所述的第二步反應過程中鹵醇脫鹵酶HHDH液的用量為反應總體積的0.5%?4.0% (w/v)，反應體系的溫度為45?50°C ;還用30%的NaCN溶液控制體系的pH至6.8?7.3。
9.根據權利要求1-8任一項所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，具體實施過程如下:在反應容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯、異丙醇、CaCl2、重組酮還原酶KREDl基因的大腸桿菌全細胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應，利用氣相色譜方法檢測反應進程；至轉化率達到80%?100%，分批加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯，繼續進行反應，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入pH 7.0的30%氰化鈉磷酸溶液，然后在真空度0.05 MPa的條件下把溫度升至50°C后保持lOmin，加入鹵醇脫鹵酶HHDH液開始第二步反應，反應過程中用30%的NaCN溶液控制體系的pH至6.8?7.3 ;利用氣相色譜方法檢測反應進程，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。
10.根據權利要求9所述的兩步催化制備(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于，底物4-氯乙酰乙酸乙酯分I?3批加入，每次加入的濃度200?800mM。
【文檔編號】C12P7/62GK104372038SQ201310347202
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司