雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于：在反應容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、異丙醇、生物催化劑，于溫度25℃～40℃下攪拌反應，利用氣相色譜方法（GC）檢測反應進程，至轉化率達到80％～100％，分批加入另一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯，繼續進行反應，至反應轉化率達到95%～100％時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯。本發明兩步反應可用一鍋法完成，如此進行生產，反應步驟簡單，可以節省生產原料和和動力能源的消耗，有效地節省了成本，在工業化應用具有十分重要的意義。
【專利說明】雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制藥和生物化工領域，具體涉及一種瑞舒伐他汀側鏈中間體的酶法制備方法。

【背景技術】
[0002]他汀類藥物是目前世界上最暢銷的藥物大類，它對膽固醇合成的關鍵限速酶3-羥基-3-甲基輔酶A (HMG-CoA)還原酶具有強烈的抑制作用，可抑制膽固醇的合成，是治療心血管疾病的重要藥物，特別是阿托伐他汀和瑞舒伐他汀近些年都進入了全球最暢銷藥前十名。(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯是合成瑞舒伐他汀的關鍵手性中間體，可以通過化學法或生物法加以制備。目前國內主要通過化學法生產，化學還原方法的反應條件往往需要低溫(如-70 °C)，及易燃的硼烷類化合物參與，成本高，純度低，污染尤其嚴重，對環境的影響非常大。相對于傳統化學法，生物法具有反應溫和，效率高，三廢產生少等優點，因此具有廣泛的應用前景。
[0003]目前生物法主要是利用生物催化(5S)_6氯-3-羰基-5-羥基己酸叔丁酯制備(3民55)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯。例如美國專利US2008/0248539公開了一種利用來自于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮還原酶及其突變株還原法生產(3R, 5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯的方法，該方法利用外源添加的葡萄糖脫氫酶和輔酶因子來維持反應的進行，而且在反應中會產生葡萄糖酸，需用堿維持反應的pH，增加了操作程序，影響反應的原子經濟性。由于(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯有兩個手性位點，目前生物法分兩步還原反應制得，如附圖1。反應過程由2步生物法和I步化學法組成。


【發明內容】

[0004]針對上述現有技術存在的問題，系統性研究兩個生物催化反應的特性，提供一種一鍋法催化制備(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯的方法，先利用化學法合成底物，優化傳統反應路線，篩選到合適的生物催化劑，同時進行兩步還原反應，即兩步反應可用一鍋法完成，如此進行生產，反應步驟簡單，可以節省生產原料和和動力能源的消耗，有效地節省了成本，在工業化應用具有十分重要的意義。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案如下:雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:在反應容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入一部分底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯、異丙醇、生物催化劑，于溫度25°C?40°C下攪拌反應，利用氣相色譜方法(GC)檢測反應進程，至轉化率達到80%?100%，分批加入另一部分底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，繼續進行反應，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯。
[0006]進一步地，所述的生物催化劑的形式為含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌或重組酮還原酶的粗酶液。
[0007]進一步地，所述的生物催化劑的制備方法為:將含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌單菌落分別接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至OD6tltl值達到0.8?1.2時，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞；用2?8倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞，細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘，4°C下15000g離心30min，上清液即得重組酮還原酶的粗酶液。
[0008]進一步地，所述的水相緩沖液為pH 6.0?8.0的磷酸鹽緩沖液或三乙醇胺緩沖液，濃度為50?300mM。其中更優選磷酸鹽緩沖液，pH6.5?7.5。
[0009]進一步地，所述的催化體系在使用重組酮還原酶的粗酶液為生物催化劑時，添加NADP作為反應輔因子，添加量為底物量的0.03%-0.3% (w/w);在使用重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞為生物催化劑時，無需添加輔因子NADP。
[0010]進一步地，在反應體系中加入的Ca2+、Mg2+等二價金屬離子，濃度為0.l_20mM，不僅可以增加大腸桿菌細胞的通透性，而且這些離子還是酮還原酶的增強劑。其中更優選Ca2+，根據一個具體方面，所述的反應體系中所用的為CaCl2。
[0011]進一步地，所述的催化體系的底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯根據反應情況分I?3批加入，每次加入的濃度200?800mM。
[0012]進一步地，第一步反應起始時的反應體系中，底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯的總共添加濃度為10%?30% (w/v),異丙醇的濃度為5%?25% (w/v),所述還原反應體系的溫度為30°C ;當選用大腸桿菌全細胞做生物催化劑時:重組酮還原酶的大腸桿菌細胞KREDl的用量為底物質量的2.0%?20.0% (w/w)，重組酮還原酶的大腸桿菌細胞KRED2的用量為底物質量的2.0%?20.0% (w/w);當選用粗酶液做生物催化劑時，重組酮還原酶的粗酶液KREDl的用量為底物質量的8.0%?80.0% (w/w)，重組酮還原酶的粗酶液KRED2的用量為底物質量的8.0%?80.0% (w/w)。
[0013]根據本發明，所用的底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯及其它使用到的原料均可商購獲得。此外，本發明中所述的重組酮還原酶KREDl和KRED2的信息，為本公司通過基因定點突變獲得的重組酮還原酶突變體，其堿基序列和制備方法分別參見申請號分別為201310345823.3和201310319519.1的中國專利申請。它人在實施本發明方法時可以按照本發明所述方法制備或購買。
[0014]由于以上技術方案的實施，本發明與已有技術相比具有如下優勢:本發明方法通過采用特定的重組酮還原酶，采用一鍋法催化制備(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯，解決了傳統生物法中步驟多以及成本高的問題。該方法反應無需添加有機溶劑、條件溫和、反應效率高、操作簡便，特別是，兩步反應共用同一個反應體系，無需提出中間體即可進行下一步反應，節省物料提取溶劑和動力能源的消耗，大大提高了效率和降低了生產成本，具有十分廣闊的工業化生產前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為傳統反應路線；
圖2本專利所述的反應路線；
圖3本發明所述的雙酶法催化過程示意圖。

【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施例。
[0017]實施例1含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌的制備方法
分別從轉化平板將含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養7小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養，培養至0D_值達到1.0時，加入誘導劑，于28°C下繼續培養20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞KREDl和KRED2。
[0018]實施例2
將實施例1所制備的含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞KREDl和KRED2用3倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎30分鐘。4°C下15000g離心30min，上清液即得重組酮還原酶KREDl和KRED2的粗酶液。
[0019]實施例3
分別從轉化平板將含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養，培養至0D_值達到0.8時，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于22°C下繼續培養20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞KREDl和KRED2。用3倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM, pH7.0)懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎30分鐘。4°C下15000g離心30min,上清液即得重組酮還原酶KREDl和KRED2的粗酶液。
[0020]實施例4
分別從轉化平板將含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養4小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養，培養至0D_值達到1.2時，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，于32°C下繼續培養16小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞KREDl和KRED2。用3倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM, pH7.0)懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎30分鐘。4°C下15000g離心30min,上清液即得重組酮還原酶KREDl和KRED2的粗酶液。
[0021]實施例5雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法
在10mL三口燒瓶中依次加入0.32g KH2PO470.37g K2HPO4.3H20，38mL去離子水，形成pH為7.0的磷酸鹽緩沖液,然后依次加入6.5g異丙醇,5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯，3.4g實施例1所制備的重組酮還原酶粗酶液KREDl，4.7g重組酮還原酶粗酶液KRED2，0.0lg無水CaCl2，0.02g NADP粉末。30 °C下磁力攪拌開始計時反應，反應路線與示意圖如圖2-3所示，6h取樣，GC分析監測轉化率98.2%，再加入5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯繼續反應，14h取樣，GC分析監測轉化率98.7%，產物的立體構型純度為99.6%，其中底物及產物的具體分析條件為:色譜柱為0.3mm毛細管柱30m(DIKMA)，FID檢測器。色譜柱溫度208 °C，氣化和檢測溫度均為230 °C，載氣流量20-30ml/min，進樣量
0.3-0.5 μ L，載氣為N2。產物立體構型純度的分析條件為:色譜柱為CP-Chirasil-DEX CB手性毛細管柱，其余條件同上。反應結束后，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并蒸發脫去溶劑，得到產物(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯10.3g。反應示意圖如圖2和圖3所示。
[0022]實施例6雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法
在10mL三口燒瓶中依次加入0.32g KH2PO470.37g K2HPO4.3H20，38mL去離子水，形成pH為7.0的磷酸鹽緩沖液,然后依次加入6.2g異丙醇,5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯，1.2g實施例2所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌細胞KRED1，1.7g重組酮還原酶的大腸桿菌細胞KRED2，0.03g無水CaCl2, 30 °C下磁力攪拌開始計時反應，反應路線與示意圖如圖2-3所示，6h取樣，GC分析監測轉化率97.5%，再加入5.5g底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯繼續反應，14h取樣，GC分析監測轉化率98.3%，產物的立體構型純度為99.7%。反應結束后，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并蒸發脫去溶劑，得到產物(3R, 5S) -6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯 9.8g。
【權利要求】
1.雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:在反應容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入一部分底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯、異丙醇、生物催化齊IJ，于溫度25°C?40°C下攪拌反應，利用氣相色譜方法(GC)檢測反應進程，至轉化率達到80%?100%，分批加入另一部分底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，繼續進行反應，至反應轉化率達到95%?100%時結束反應，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶齊U，即得(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯。
2.根據權利要求1所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的生物催化劑的形式為含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌或重組酮還原酶的粗酶液。
3.根據權利要求2所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的生物催化劑的制備方法為:將含有酮還原酶基因KREDl和KRED2的重組大腸桿菌單菌落分別接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養，培養至OD6tltl值達到0.8?1.2時，加入誘導劑，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞；用2?8倍體積的三乙醇胺緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細胞，細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘，4°C下15000g離心30min,上清液即得重組酮還原酶的粗酶液。
4.根據權利要求1所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的水相緩沖液為pH 6.0?8.0的磷酸鹽緩沖液或三乙醇胺緩沖液，濃度為50?300mM。
5.根據權利要求4所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的水相緩沖液為PH6.5?7.5的磷酸鹽緩沖液。
6.根據權利要求1所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的催化體系在使用重組酮還原酶的粗酶液為生物催化劑時，添加NADP作為反應輔因子，添加量為底物量的0.03%-0.3% (w/w);在使用重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞為生物催化劑時，無需添加輔因子NADP。
7.根據權利要求1所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:在反應體系中加入的Ca2+、Mg2+等二價金屬離子，濃度為0.l-20mM。
8.根據權利要求7所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的二價金屬離子為Ca2+。
9.根據權利要求1所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于:所述的催化體系的底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯分I?3批加入，每次加入的濃度200 ?800mM。
10.根據權利要求1所述的雙酶法制備瑞舒伐他汀側鏈中間體的方法，其特征在于--第一步反應起始時的反應體系中，底物6-氯-3，5- 二羰基己酸叔丁酯的濃度為10%?30%(w/v),異丙醇的濃度為5%?25% (w/v),所述還原反應體系的溫度為30°C ;當選用大腸桿菌全細胞做生物催化劑時:重組酮還原酶的大腸桿菌細胞KREDl的用量為底物質量的.2.0%?20.0% (w/w)，重組酮還原酶的大腸桿菌細胞KRED2的用量為底物質量的2.0%?.20.0% (w/w);當選用粗酶液做生物催化劑時，重組酮還原酶的粗酶液KREDl的用量為底物質量的8.0%?80.0% (w/w)，重組酮還原酶的粗酶液KRED2的用量為底物質量的8.0%?.80.0% (w/w) ο
【文檔編號】C12R1/19GK104372039SQ201310347204
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司