一種高酰基結冷膠的提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種高酰基結冷膠的提取方法，包括發酵、分離去除菌體蛋白、醇絮凝、膜濾、鹽析以及干燥等步驟提取高酰基結冷膠產品。本發明還提供了一種生產高酰基結冷膠的復合菌液。本發明提取方法可以提高高酰基結冷膠的產量，節省原料，還能將廢物有效回收利用，適合工業規模化生產。
【專利說明】一種高酰基結冷膠的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物技術生產領域，尤其涉及一種高酰基結冷膠的提取方法。【背景技術】
[0002]結冷膠是繼黃原膠后的又一新型微生物胞外多糖，具有優良的凝膠性能，是由四個糖分子依次為D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖通過糖苷鍵連接而成的高分子，其中第一個葡萄糖分子是以β_1，4糖苷鍵連接。由于結冷膠具有優越的凝膠性能，其被廣泛的應用在食品領域，如奶制品、果肉飲料、果醬制品、布丁果凍及面包填料等，也應用在非食品領域中，如牙膏、藥物的緩慢釋放、微生物培養基等。
[0003]結冷膠應用在奶制品中，將結冷膠加熱到70°C~75°C可直接水合于奶中，在酸性奶制品中加入此種水溶膠充當膠體保護劑，可以消除奶制品中的蛋白質絮凝及口感的作用；用于糖果中，可給產品提供優越的結構和質地，并縮短淀粉軟糖膠體形成的時間；結冷膠加入到餅干制品中可以減少飽和脂肪酸的用量，并改良餅干的層次，使餅干具有良好的疏松度；結冷膠也可替代果膠制備果醬和果凍，也能用于糕點和水果餡餅填料中；在肉制品和蔬菜類的加工過程中，添加結冷膠可彌補產品的口味不足，使其具有清爽的品味特點。
[0004]按照結冷膠多糖分子中乙酰基的含量通常將結冷膠產品分為兩種:一種是低酰基結冷膠，通過對高酰基結冷膠作脫酰基或部分脫酰基處理得到，水化后在陽離子作用下易形成脆性凝膠；另一種是高酰基結冷膠，即天然結冷膠，水化后易形成粘彈性凝膠。生產中通常根據需要將兩種結冷膠按不同的比例進行混合，使其具有更好的應用效果。現有技術CN201210088884公開了一種結冷膠的發酵工藝，該方法存在結冷膠產率不高、步驟復雜并且需要添加PH調節劑等問題。如何開發一種結冷膠的產量高以及工業能耗低的綠色提取工藝實現有技術急待解決的技術問題。

【發明內容】

[0005]為了克服現有技術的不足，提高高酰基結冷膠的產量，節省原料以及廢物回收利用，本發明提供了一種高酰基結冷膠的提取方法，包括以下制備步驟:
[0006]第一步，將混合菌液(少動鞘脂單胞菌液和短小芽孢桿菌液重量比為10: 1，兩種菌液中菌體的濃度均為I X IO8個/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為30°C，PH值7.2的條件下，培養24小時得到液體A，然后按液體A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度30°C，PH值7.2，培養時間72小時，得到發酵液；其中，種子罐培養基的組分為:鹿糖25g,蛋白胨5g,硫酸銨4.0g,酵母膏3.0g,檬酸3.5g，碳酸鈣2.0g，蒸餾水1000ml ;發酵罐培養基的組分為:蔗糖40g，蛋白胨Sg，磷酸二氫鉀3g，梓檬酸2.5g，碳酸鈣2.0g,硫酸鎂Ig,蒸懼水1000ml ；
[0007]第二步，在第一步獲得的發酵液內同時加入硅藻土和氣相二氧化硅的混合物，邊添加邊攪拌，攪拌lOmin，攪拌速度為lOOr/min，然后用板框過濾，分別收集過濾后的濾液和菌體；其中所述混合物的添加量為發酵液重量的0.5%，所述硅藻土和氣相二氧化硅的質量比為3: I ;所述氣相二氧化硅的比表面積為200m2/g以上；
[0008]第三步，向第二步得到的濾液中加入2~3倍體積的70%~90%乙醇，混合均勻，絮凝結冷膠；然后經膜過濾除去廢液，得到絮凝結冷膠；并且低溫旋轉蒸發回收廢液中的乙醇后，得到液體B ;將上述絮凝結冷膠重新分散和溶解于水，得到結冷膠液體，然后加入結冷膠液體體積6%~7%的氯化鈉溶液，沉淀析出結冷膠；
[0009]第四步，將第三步析出的結冷膠經螺桿式壓榨機，去除多余的水分，得濕品結冷膠；然后將濕品結冷膠干燥、粉碎即得高酰基結冷膠；
[0010]第五步，將第二步獲得的菌體以及第三步獲得的液體B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、高粱粉、豆渣以及麥麩，邊添加邊攪拌至糊狀；最后通入蒸汽升溫至110°C，蒸餾15分鐘；然后將蒸餾物烘干、粉碎后，添加硫酸鋅、維生素E以及綠原酸，混合均勻，獲得豬飼料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麥麩分別占混合溶液質量的6%，5%，2%和1%，硫酸鋅、維生素E以及綠原酸分別占混合溶液質量的萬分之一。
[0011]本發明還公開了一種生產高酰基結冷膠的復合菌液，其由少動鞘脂單胞菌液和短小芽孢桿菌液按照重量比為10: I混合而成，兩種菌液中菌體的濃度均約為IXio8個/mL。
[0012]本發明使用的少動鞘脂單胞菌和短小芽孢桿菌為本領域常用的菌株，優選少動鞘脂單胞菌 Sphingomonas paucimobilis (ATCC31461,參見 J Ind MicrobiolBiotechnol.20020ct ；29(4):170-6.)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) (ATCC27142，參見 Journal of Food Protectionl995, Volume58, Number4)。
[0013]本發明取得的有益效果主要如下:
[0014]通過多次試驗和研究，開拓性地在少動鞘脂單胞菌發酵中添加 了短小芽孢桿菌，使得短小芽孢桿菌能夠有效地降解少動鞘脂單胞菌產生的各類酸性物質，并且使得發酵液始終維持在弱堿性條件下，保持少動鞘脂單胞菌發酵效果維持在較高的狀態；
[0015]少動鞘脂單胞菌發酵產生結冷膠的最佳pH為7.2左右，但是在發酵過程中會產生多種酸性物質，包括羥基丁酸等，使得發酵環境往酸性條件演化，不利用少動鞘脂單胞菌的發酵，使得結冷膠的產量降低，而短小芽孢桿菌通過與少動鞘脂單胞菌的協同共生，促進了結冷膠的生成；并且降低了結冷膠中各類酸性物質的含量，提高了結冷膠的純度。
[0016]發酵液中無需添加pH調節劑，減少了原料的浪費，節約了成本；
[0017]提取過程中減少了現有技術中其他提取方法使用的各類化學物質，避免了將化學物質帶入到結冷膠中；
[0018]在提取結冷膠的過程中，對菌體蛋白、大分子多糖等進行了回收，避免了此類物質的廢液對環境造成的污染；同時，獲得了營養豐富的菌體蛋白飼料，變廢為寶，增加經濟效益；同時實現了結冷膠提取過程綠色環保，幾乎無廢水外排，料液組分充分利用。
【具體實施方式】
[0019]以下將采用具體的實施例來對本發明作進一步的解釋，但是不應當看作是對本發明創新精神的限制。
[0020]實施例1
[0021]一種高酰基結冷膠的提取方法，包括以下制備步驟:
[0022]第一步，將混合菌液(少動鞘脂單胞菌液(ATCC31461)和短小芽孢桿菌液(ATCC27142)重量比為10: 1，兩種菌液中菌體的濃度均為I X IO8個/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為30°C，PH值7.2的條件下，培養24小時得到液體A，然后按液體A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度30°C，PH值7.2，培養時間72小時，得到發酵液；其中，種子罐培養基的組分為:蔗糖25g，蛋白胨5g,硫酸銨4.0g,酵母膏3.0g,檸檬酸3.5g,碳酸鈣2.0g,蒸懼水1000ml ;發酵罐培養基的組分為:蔗糖40g，蛋白胨Sg，磷酸二氫鉀3g，檸檬酸2.5g，碳酸鈣2.0g，硫酸鎂lg，蒸餾水1000ml ；
[0023]第二步，在第一步獲得的發酵液內同時加入硅藻土和氣相二氧化硅的混合物，邊添加邊攪拌，攪拌lOmin，攪拌速度為lOOr/min，然后用板框過濾，分別收集過濾后的濾液和菌體；其中所述混合物的添加量為發酵液重量的0.5%，所述硅藻土和氣相二氧化硅的質量比為3: I ;所述氣相二氧化硅的比表面積為200m2/g以上；
[0024]第三步，向第二步得到的濾液中加入2倍體積的80%乙醇，混合均勻，絮凝結冷膠；然后經膜過濾除去廢液，得到絮凝結冷膠；并且低溫旋轉蒸發回收廢液中的乙醇后，得到液體B ;將上述絮凝結冷膠重新分散和溶解于水，得到結冷膠液體，然后加入占結冷膠液體體積7 %的飽和氯化鈉溶液，沉淀析出結冷膠；
[0025]第四步，將第三步析出的結冷膠經螺桿式壓榨機，去除多余的水分，得濕品結冷膠；然后將濕品結冷膠干燥、粉碎即得高酰基結冷膠；
[0026]第五步，將第二步獲得的菌體以及第三步獲得的液體B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、高梁粉、豆渣以及麥麩，邊添加邊攪拌至糊狀；最后通入蒸汽升溫至110°C，蒸餾15分鐘；然后將蒸餾物烘干、粉碎后，添加硫酸鋅、維生素E以及綠原酸，混合均勻，獲得豬飼料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麥麩分別占混合溶液質量的6%，5%，2%和1%，硫酸鋅、維生素E以及綠原酸分別占混合溶液質量的萬分之一。
[0027]實施例2 [0028]實施例1制備的高酰基結冷膠的性能參數:
[0029]對照組:僅采用少動鞘脂單胞菌發酵生產結冷膠，其他步驟同實施例1 ;實驗組為實施例1制備的結冷膠。對照組高酰基的分子量為165萬道爾頓，實驗組的結冷膠的平均分子量在162萬道爾頓。
[0030]粘度測定方法:常溫下，4號轉子，30r/min條件測定。
[0031]膠體純度參加GB25535-2010。
[0032]膠體懸浮性能和彈性試驗操作步驟參見:李龍偉等，現代農業科技2011年第18期。
[0033]
【權利要求】
1.一種高酰基結冷膠的提取方法，其包括以下制備步驟: 第一步，將混合菌液按照10%的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為30°C，PH值7.2的條件下，培養24小時得到液體A，然后按液體A:發酵罐培養基為1: 10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度30°C，PH值7.2，培養時間72小時，得到發酵液；其中，種子罐培養基的組分為:鹿糖25g,蛋白胨5g,硫酸銨4.0g,酵母膏3.0g,檸檬酸3.5g,碳酸鈣2.0g,蒸餾水1000ml ;發酵罐培養基的組分為:蔗糖40g，蛋白胨Sg，磷酸二氫鉀3g，檸檬酸2.5g，碳酸鈣2.0g，硫酸鎂lg，蒸餾水1000ml ； 第二步，往第一步獲得的發酵液加入硅藻土和氣相二氧化硅的混合物，邊添加邊攪拌，攪拌IOmin,攪拌速度為100r/min,然后用板框過濾,分別收集過濾后的濾液和菌體；其中所述混合物的添加量為發酵液重量的0.5%，所述硅藻土和氣相二氧化硅的質量比為3:1; 第三步，向第二步得到的濾液中加入2~3倍體積的70%~90%乙醇，混合均勻，然后經膜過濾除去廢液，得到絮凝結冷膠；并且低溫旋轉蒸發回收廢液中的乙醇后，得到液體B ;將上述絮凝結冷膠重新分散和溶解于水，得到結冷膠液體，然后加入占結冷膠液體體積6%~7%的堿金屬離子溶液，沉淀析出結冷膠； 第四步，將第三步析出的結冷膠經螺桿式壓榨機，去除多余的水分，得濕品結冷膠；然后將濕品結冷膠干燥、粉碎即得高酰基結冷膠； 第五步，將第二步獲得的菌體以及第三步獲得的液體B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、高梁粉、豆渣以及麥麩，邊添加邊攪拌至糊狀；最后通入蒸汽升溫至110°C，蒸餾15分鐘；然后將蒸餾物烘干、粉碎后，添加硫酸鋅、維生素E以及綠原酸，混合均勻，獲得豬飼料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麥麩分別占混合溶液質量的和1%，硫酸鋅、維生素E以及綠原酸分別占混合溶液質量的萬分之一。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一步中的混合菌液由少動鞘脂單胞菌液和短小芽孢桿菌液按照重量比為10: I混合而成，所述少動鞘脂單胞菌液或所述短小芽孢桿菌液菌液中菌體的濃度均為I X IO8個/mL。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣相二氧化硅的比表面積為200m2/g以上。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述少動鞘脂單胞菌為少動鞘脂單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) ATCC31461,所述短小芽抱桿菌為短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)ATCC27142。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三步中采用的堿金屬離子溶液為飽和氯化鈉溶液或飽和氯化鈣溶液。
【文檔編號】C12P39/00GK103509845SQ201310347826
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】潘悅洪, 肖勇, 莊會華, 邱玲 申請人:新疆阜豐生物科技有限公司