生產高純度手性meso-2,3-丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株及構建及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種生產高純度手性meso-2,3-丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株及構建及應用，構建方法為：在枯草芽孢桿菌中敲除2,3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途徑中acoA基因、敲除乙偶姻還原酶編碼基因bdhA、敲除副產物乙酸生成途徑pta基因和敲除副產物乳酸生成途徑ldh基因，使用P43強啟動子過表達合成支路alsSD操縱子、使用P43強啟動子過表達meso-2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因budC和使用P43強啟動子過表達還原力平衡過程轉氫酶編碼基因udhA。本發明所構建的枯草芽孢桿菌工程菌安全無害，可以利用葡萄糖為底物生產手性純度大于99％的meso-2,3-丁二醇。
【專利說明】生產高純度手性meso-2, 3- 丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株及構建及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術與應用領域，具體地涉及一種生產高純度手性丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株及構建及應用。
【背景技術】
[0002]2，3- 丁二醇(2，3-Butanediol)分子中含有2個手性碳原子，存在3種旋光異構體，分別為D-(-)-2，3- 丁二醇、L-(+)-2，3- 丁二醇和meso-2，3- 丁二醇。作為一種重要的化工原料和液體燃料，2，3- 丁二醇廣泛應用于化工、食品等領域。2，3- 丁二醇的燃燒值為27.2kJ/g，與甲醇(22.lkj/g)和乙醇(29.0kJ/g)相當，它具有較高的辛烷值，是一種潛在價值很高的燃料添加劑。2，3- 丁二醇及其衍生物還有眾多潛在的應用，如生產油墨、香水、熏劑、氨綸、增濕劑、軟化劑、塑化劑以及藥物載體等。2，3-丁二醇可轉化為1，3_ 丁二烯而用于合成橡膠的生產，其衍生的化學品也可用于塑料及溶劑的生產。脫水產物2-丁酮(燃燒熱略高于乙醇)是一種重要的燃料添加劑和有機溶劑。脫氫產物雙乙酰和3-羥基丁酮可作為風味物質和防 腐劑用于食品和香料行業。特別提到的是，手性2，3-丁二醇在不對稱合成方面有著巨大的潛在優勢，同時可以用于高附加值的藥物中間體和液晶材料等精細化學品。Meso-2，3- 丁二醇雖然目前市場需求不大，但附加值比僅用作燃料的2，3- 丁二醇的混合物附加值高很多，有著潛在的發展空間。
[0003]與傳統化學合成法相比，2，3-丁二醇的微生物發酵法對環境友好，工藝簡單，技術上較為成熟，符合綠色化工的要求。但值得注意的是，目前2，3_ 丁二醇的高產菌種大都是病原菌，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、以及陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)等微生物，而大規模工業化生產的安全性原則在很大程度上限制了這些生產菌株的應用，因此迫切需要開發出2，3- 丁二醇的產量、得率、生產效率以及光學純度高并且安全可靠的代謝工程菌株。另外很多生產菌種生產的是兩種2，3- 丁二醇旋光異構體的混合物，這也為后續高純度異構體的分離帶來了困難。利用代謝工程或合成生物學方法對模式菌株的代謝途徑進行重新設計和合理改造是一種較好的策略，雖然有人對大腸桿菌(Escherichia coli)生產手性2，3- 丁二醇的研究已經較為深入，但2，3- 丁二醇的得率、產量、產率等方面并不理
本巨
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[0004]枯草芽孢桿菌作為生產菌株具有以下幾點優勢:1.它是一種安全的非病原微生物(Classl,Generally Regard As Safe)。2.枯草芽孢桿菌對木糖、阿拉伯糖、甘油等底物的利用能力較強，很適合以半纖維素和纖維素水解液或重要工業副產物甘油為原料進行化學品的生產，有利于降低大規模生產的成本。3.作為革蘭氏陽性菌，它對酸、醇類、高溫、高濃度糖及高濃度鹽的耐受性要強于革蘭氏陰性菌。4.作為一種重要的模式菌株，對其生理生化特性及遺傳背景已經有了比較深入的了解，相關的分子生物學方法和基因操作技術都比較成熟，有利于通過代謝工程及合成生物學的合理設計來改進菌種。
[0005]經檢索，目前未見有使用代謝工程改造枯草芽孢桿菌并利用其生產手性meso-2, 3- 丁二醇的報道。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能高效率地生產高純度手性meso-2, 3- 丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株。
[0007]本發明的第二個目的是提供一種生產高純度手性meso-2，3_ 丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株的構建方法。
[0008]本發明的第三個目的是提供一種生產高純度手性meso-2，3_ 丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株的應用。
[0009]本發明的技術方案概述如下:
[0010]一種生產高純度手性meso-2, 3_ 丁二醇的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株構建方法，包括如下步驟:在枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168中敲除2，3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途徑中acoA基因、敲除乙偶 姻還原酶編碼基因bdhA、敲除副產物乙酸生成途徑Pta基因和敲除副產物乳酸生成途徑Idh基因，使用P43強啟動子過表達合成支路alsSD操縱子、使用P43強啟動子過表達meso-2，3_ 丁二醇脫氫酶編碼基因budC和使用P43強啟動子過表達還原力平衡過程轉氫酶編碼基因udhA。
[0011]上述方法構建的生產高純度手性meso-2，3-丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株。
[0012]上述生產高純度手性meso-2，3_ 丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株生產高純度手性meso-2, 3- 丁二醇的用途。
[0013]有益效果
[0014]本發明所構建的枯草芽孢桿菌工程菌安全無害，克服了目前生物法制備2，3- 丁二醇的高產發酵菌株多為條件致病菌的缺點，可以利用葡萄糖為底物生產手性純度大于99%的meso-2，3- 丁二醇，且在搖瓶的發酵結果為48g/L以上，這為后續發酵罐連續補料提高meso-2，3- 丁二醇的產量和產率奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為基因操作革巴點。
[0016]圖2為手性2，3- 丁二醇的氣相色譜檢測。
[0017]圖3為p⑶-acoA-FB質粒的構建過程。
[0018]圖4為pCU-bdhA-FB質粒載體的圖譜。
[0019]圖5為p⑶-pta-FB敲除載體的圖譜。
[0020]圖6為p⑶-1dh-FB敲除載體的圖譜。
[0021]圖7為pPSDBUE整合載體圖譜。
[0022]圖8為pCU-bdhA-FB-PSD整合載體的圖譜。
[0023]圖9為電泳驗證圖譜。
【具體實施方式】[0024]下面結合實施例對本發明做進一步說明，下述實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但對本發明不作任何限制。
[0025]本發明所用到的原始菌株B.subtilis 168來源為BGSC(Bacillus Genetic StockCenter, http://www.bgsc.0rg/)。
[0026]原始質粒pC194和 pHP13 來源為 BGSC(Bacillus Genetic Stock Center, http: //www.bgsc.0rg/)0
[0027]所用2，3_ 丁二醇標準品從 sigma 公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)購買。
[0028]所用限制性內切酶、去磷酸化酶、DNA連接酶等分子生物學試劑從thermo公司購買(http://www.thermoscientificbi0.com/fermentas)。
[0029]所用其他生化試劑從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://WWW.sangon.com/)。
[0030]實施例1 無抗生素標記篩選枯草芽孢桿菌系統出發菌株的構建和基礎操作質粒P⑶的構建
[0031]( I)無抗生素標記篩選枯草芽孢桿菌系統出發菌株的構建
[0032]以在枯草芽孢桿菌B.subtilisl68中敲除了 upp基因而獲得的菌株為無抗生素標記篩選枯草芽孢桿菌系統出發菌株，命名為BSFl。
[0033]無抗生素標記篩選枯草芽孢桿菌系統出發菌株的構建步驟如下:
[0034]使用含有upp基因上下游同源臂和neo抗性標記的質粒通過Spizizen轉化到枯草芽孢桿菌B.subtilis 168中，在含有5ug/mL的卡那霉素的LB平板上篩選出轉化子，經菌落PCR驗證，得到upp基因敲除的出發菌株BSFl。本發明對該菌株的構建方法不做限定，也可以用其它的方法進行構建，參考文獻I中公開了相關方法。
[0035]( 2)基礎操作質粒p⑶的構建
[0036]利用PCR反應以pC194質粒為模版使用上下游引物Kit-Fsn-catU和Kit-Fsn-catL獲取cat基因、以B.subtilis 168基因組為模版使用上下游引物Kit-fsn-uppU和Kit-fsn-uppL獲取upp基因，再以上面的兩個片段為模版,利用融合PCR反應使用上下游引物Kit-fsn-U和Kit-fsn-L獲取重組片段cat-upp。將該重組片段與PUC18 (通用載體)質粒經酶切、酶連、轉化、驗證等操作后，得到基礎操作質粒p⑶。本發明對該基礎操作質粒PCU的構建方法以及抗性基因的選擇不做限定，參考文獻I中公開了相關方法。
[0037]實施例2:2，3- 丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途徑中acoA基因的敲除
[0038]敲除乙偶姻(2，3-丁二醇的直接底物)降解途徑acoA基因的具體操作如下:
[0039]利用D_acoA_FU、D_acoA_FL 和 D_acoA_BU、D_acoA_BL 兩對引物，以 B.subtilis168為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為1143bp和1208bp的上下游同源臂acoA-F和acoA-B。經切膠回收后利用引物D-acoA-FsnU、D-acoA_FsnL,同樣使用KOD-plus高保真DNA聚合酶進行融合PCR擴增，得到上下游同源臂的2073bp的拼接產物acoA-FB。然后將融合產物acoA-FB和pCU質粒使用Thermo Fast digest Sail和KpnI雙酶切，經連接、轉化后得到acoA基因敲除載體p⑶-acoA-FB (見圖3)。將測序結果正確的質粒通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿BSFl中，用含氯霉素LB固體培養基中篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml LB液體培養基中，200rpm震蕩培養6h (OD約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養基上挑出菌落，使用引物D-acoA-FU、D-acoA-BL進行PCR驗證，得到acoA基因敲除菌株BSF2，驗證見圖9A，其中M為Ikb DNAladder (條帶從下到上依次為 250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000、6000、8000、10000bp，下同)，1泳道為以B.subtilis 168為模版擴增所得片段，2泳道為以BSF2為模版擴增所得片段。
[0040]其中，LB液體培養基配方為:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，調節pH至7.5。0.1Mpa壓力下滅菌20min。
[0041]LB固體培養基配方為:在LB液體培養基中加入瓊脂粉(終濃度15g/L)，0.1Mpa壓力下滅菌20min。
[0042]實施例3:乙偶姻還原酶編碼基因bdhA基因的尚支除
[0043]利用D-bdhA-FU、D-bdhA-FL 和 D-bdhA-BU、D-bdhA-BL 兩對引物，以 B.subtilis168為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為1096和973bp的上下游同源臂bdhA-F和bdhA-B。切膠回收后利用引物D-bdhA-FsnU、D-bdhA-FsnL,同樣使用KOD-plus高保真DNA聚合酶進行融合PCR擴增，得到上下游同源臂的1796bp的拼接產物bdhA-FB。然后將融合產物bdhAFB和pCU質粒使用Thermo Fast digest SphI和KpnI雙酶切，經連接、轉化后得到bdhA基因敲除載體p⑶-bdhA-FB (見圖4)。將測序結果正確的質粒通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿BSF2中，用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml卡那抗性培養液中，200rpm震蕩培養6h (0D約為2)，并在5-氟尿嘧啶基本培養基上挑出菌落，使用引物D-bdhA-FU、D-bdhA-BL進行PCR驗證，得到bdhA基因敲除菌株BSF3，驗證見圖9B，其中M為Ikb DNA ladder，l泳道為以B.subtilis 168為模版擴增所得片段，2泳道為以BSF3為模版擴增所得片段。
[0044]實施例4:副產物 乙酸生成途徑pta基因與副產物乳酸生產途徑Idh基因的敲除
[0045]敲除乙酸生成途徑pta基因具體操作如下:
[0046]利用D-pta-FU、D-pta_FL 和 D_pta-BU、D-pta_BL 兩對引物，以 B.subtilis 168 為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為908bp和948bp的上下游同源臂pta-F和pta-B。經切膠回收后利用引物D-pta-FsnU、D-pta-FsnL,同樣使用KOD-plus高保真DNA聚合酶進行融合PCR擴增，得到上下游同源臂的1728bp的拼接產物pta_FB。然后將融合產物PtaFB和p⑶質粒使用Thermo Fast digest SphI和KpnI雙酶切,經連接、轉化后得到Pta基因敲除載體p⑶-pta-FB (見圖5)。將測序結果正確的質粒通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿BSF3中，用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml卡那抗性培養液中，200rpm震蕩培養6h (0D約為2)，并在5-氟尿嘧啶基本培養基上挑出菌落，使用引物D-pta-FU、D-pta_BL進行PCR驗證，得到pta基因敲除菌株BSF4，驗證見圖9C，其中M為Ikb DNA ladder，I泳道為以B.subtilis 168為模版擴增所得片段，2泳道為以BSF4為模版擴增所得片段。
[0047]敲除乳酸生成途徑Idh基因具體操作如下:
[0048]利用D-ldh-FU、D-ldh-FL 和 D-ldh-BU、D-ldh_BL 兩對引物，以 B.subtilis 168 為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為1067和1134bp的上下游同源臂Idh-F和ldh-B。經切膠回收后利用引物D-ldh-FsnU、D-1dh-FsnL,同樣使用KOD-plus高保真DNA聚合酶進行融合PCR擴增，得到上下游同源臂的2090bp的拼接產物ldh_FB。然后將融合產物Idh-FB和p⑶質粒使用Thermo Fast digest AatII雙酶切，經連接、轉化后得到Idh基因敲除載體p⑶-1dh-FB (見圖6)。將測序結果正確的質粒通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿BSF2中，用氯霉素篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml卡那抗性培養液中，200rpm震蕩培養6h (OD約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養基上挑出菌落，使用引物D-ldh-FU、D-ldh-BL進行PCR驗證，得到Idh基因敲除菌株BSF5，驗證見圖9C，其中M為Ikb DNA ladder，3泳道為以B.subtilis 168為模版擴增所得片段，4泳道為以BSF5為模版擴增所得片段。
[0049]實施例5:使用P43強啟動子過表達合成支路alsSD操縱子、meso-2, 3_ 丁二醇脫氫酶編碼基因budC和還原力平衡過程轉氫酶編碼基因udhA
[0050]使用引物0-P43-U、0-P43-L以B.subtilisl68基因組為模版擴增所得的片段和pUC18質粒分別經EcoRI和BamHI雙酶切后，連接、轉化、驗證得到質粒pP ;將使用引物0-udhA-U、0-udhA-L以E.coli基因組為模版擴增所得的擴增片段和pP質粒分別經XbaI和SalI雙酶切后同理構建出質粒pPU ;將使用引物0-alsSD-U、0-alsSD-L以B.subtilisl68基因組為模版擴增所得的擴增片段和Pl3U質粒分別經SmaI和BamHI雙酶切、純化和酶連，構建出質粒PPSDU ;后者與使用引物0-budC-U/L以K.pneumoniae CICC 10011基因組為模版擴增所得的片段分別經BamHI單酶切去磷酸化后，連接、轉化、驗證得到質粒pPSDBU ;將使用引物0-EM-U、0-EM-L以質粒pHP13為模版擴增所得含有紅霉素抗性基因erm的片段和pPSDBU質粒經Aat 11單酶切后純化和酶連，構建出pPSDBUE質粒(見圖7 )。最后，將pPSDBUE質粒通過Spizizen轉化導入BSF6中，通過終濃度0.6ug/mL的紅霉素篩選出過表達alsS,&180，1311(1(:，11(11-基因的85?9，驗證見圖9(:，其中]\1為11* DNA ladder，5 泳道為以 BSF9 為模版，0-P43-U和0-udhA-L為引物擴增所得片段。
[0051]構建BSF6的具體操作過程如下:以pPSDBUE質粒為模版，使用引物0peron-U_P43和Operon-L-alsSD擴增得到P43過表達alsSD兩個基因的3005bp的操縱子片段。所得PCR產物兩端為AflII和XhoI酶切位點，將其與pCU-bdhA-FB經Fast digest AflII和XhoI雙酶切，純化和酶連后得到大小為8.9kp的過表達載體p⑶-bdhA-FB-PSD (見圖8)。在BSF5中通過上述正負篩選，得到在B.subtilis基因組bdhA基因內部插入P43過表達的alsSD操縱子，構建出菌株BSF6。
[0052]本發明涉及的基因操作見圖1，圖1中“X”表示敲除，下劃線表示過表達，虛線表示該途徑不在本申請討論的范圍內。
[0053]本發明中的菌株代號如BSFl-BSF6，BSF9等是為了方便描述，但不應理解為對本發明的限定。
[0054]表I菌株構建所用引物序列
[0055]
【權利要求】
1.一種生產高純度手性meso-2, 3-丁二醇的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株構建方法，其特征是包括如下步驟:在枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168中敲除2,3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途徑中acoA基因、敲除乙偶姻還原酶編碼基因bdhA、敲除副產物乙酸生成途徑Pta基因和敲除副產物乳酸生成途徑Idh基因，使用P43強啟動子過表達合成支路alsSD操縱子、使用P43強啟動子過表達meso-2，3- 丁二醇脫氫酶編碼基因budC和使用P43強啟動子過表達還原力平衡過程轉氫酶編碼基因udhA。
2.權利要求1所述的方法構建的生產高純度手性meso-2，3-丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株。
3.權利要求 3的生產高純度手性meso-2，3-丁二醇的枯草芽孢桿菌菌株的用途。
【文檔編號】C12P7/18GK103451141SQ201310348096
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】陳濤, 付晶, 王智文, 趙學明 申請人:天津大學