一種通過同源重組敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種高山被孢霉（Mortierella?alpinaATCC32222）的尿嘧啶營養缺陷型菌株及其構建方法。本發明采用高山被孢霉ATCC32222為材料，運用根癌農桿菌介導的遺傳操作技術進基因敲除，得到一株高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型，對產油真菌高山被孢霉ATCC32222的基礎理論研究及產品開發具有重要的意義。
【專利說明】—種通過同源重組敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型及其構建方法
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及一種高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株及其構建方法，屬于生物工程【技術領域】。
【【背景技術】】
[0002]高山被孢霉是一種重要的花生四烯酸(ARA)生產菌株，它具有ARA含量高、安全、多不飽和脂肪酸(PUFAs)組成合理等特點，已經應用于工業生產ARA。目前對高山被孢霉的研究主要集中在菌種選育和發酵條件優化等方面。高山被孢霉的基因操作系統目前還沒有被很好的建立起來。這就對高山被孢霉脂肪酸合成途徑的基礎理論研究和基因工程改造形成了極大的障礙。目前廣泛使用的絲狀真菌轉化篩選標記有以下三種:營養缺陷型標記、抗生素抗性標記和熒光報道基因。營養缺陷型菌株經基因工程改造后，無外源抗性標記基因殘留，可以用于工業生產。所以，獲得性狀良好的營養缺陷型菌株在工業微生物育種、遺傳學、醫學、食品生物技術等領域都有著非常重要的作用。但是，目前獲得絲狀真菌營養缺陷型菌株主要依賴于誘變篩選的方法。這種方法效率極低且經常伴隨著基因組中其他位置DNA序列中未知的突變。這種由誘變得來的無表型特征的帶有遺傳背景隱患的菌株可能為以后的基因工程改造和工業生產帶來不可預知的麻煩。
[0003]利用同源重組實現的基因敲除方法可以在不影響基因組中其他基因的前提下破壞目的基因，使目的基因編碼的蛋白喪失功能，而且，與隨機誘變相比，同源重組效率相對較高，通過同源重組獲得目的菌株的重復性好。可見，利用同源重組定向打斷目的基因，是獲得優良營養缺陷型菌株的最佳方法。但是，對于絲狀真菌來說，同源重組的效率受很多因素的影響:同源序列的長度、相似性、G/C含量、靶基因的轉錄狀態、非同源末端連接、染色質結構和轉化方法。在一些酵母菌中，同源序列只需達到50-100bp即可實現同源重組；而絲狀真菌通常需要Ikb以上甚至幾kb的高質量同源性序列。并且不同菌株、不同基因的敲除需要滿足不同的條件，些許 的序列差異都可能導致同源重組的失敗。乳清酸磷酸核糖轉移酶(OPRTase)是高山被孢霉合成尿嘧啶合成代謝途徑中的關鍵酶。使編碼OPRTase的ura5基因失活，可以獲得高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株。但是，由于ura5基因在細胞生命過程中具有極其重要的地位，導致了真核細胞的自我防御與修復機制作用十分敏感。用基因敲除的方法靶向失活ura5基因構建絲狀真菌的尿嘧啶營養缺陷型菌株，在國際上一直未有公開報道的成功先例。
[0004]難以被轉化是絲狀真菌基因操作系統遠遠落后于與其他物種的重要原因之一。在國內一直未見對高山被孢霉遺傳操作的先例。根癌農桿菌介導的轉化方法已經被越來越多的應用到絲狀真菌中，和其它轉化方法相比具有四個優點:一、受體細胞可以是孢子或菌絲，不需制備原生質體。二、選擇具有單核的孢子作為受體時可避免菌絲的多核所造成的轉化子不穩定的問題。三、該方法利用天然的轉化載體系統，轉化效率高，成功率高，載體可容納大片段的異源DNA，且基本上為單拷貝插入。四、該方法可以提高同源重組效率。因此，通過根癌農桿菌的轉化為高山被孢霉ura5基因靶向失活提供了有效操作手段。
[0005]高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株為這種重要的PUFAs生產菌株的基因操作提供了先決條件。這種營養缺陷性菌株既可用于對產油真菌脂肪酸合成與積累的理論研究，也可用于基因工程改造，具有成為PUFAs超級工業生產菌株的潛力。
【
【發明內容】
】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株。所述營養缺陷型菌株是通過同源重組的方法祀向缺失Mortierella alpina ATCC32222ura5基因(654bp)中的213bp_230bp共18bp的序列實現的。
[0007]所述同源重組的同源臂DNA序列來源于Mortierella alpina ATCC32222基因組(DDBJ/EMBL/GenBank accession ADAG00000000, first version ADAGO1000000)中，ura5基因上游1393bp (-1180至+212)和下游1362bp (+231至+1592)的片段。
[0008]本發明還提供了一種構建高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株的方法，所述方法包括獲得ura5敲除基因片段，并利用ura5敲除基因片段進一步構建敲除質粒pBIG4K0ura5。然后用重組質粒pBIG4K0ura5轉化根癌農桿菌，最后用經轉化的含質粒pBIG4K0ura5的根癌農桿菌轉化高山被孢霉并對轉化后的高山被孢霉進行篩選和鑒定，獲得尿嘧啶營養缺陷型菌株。具體步驟如圖1，用PCR的方法獲得質粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。用限制性內切酶NheI和MunI，EcoRI和XbaI分別對MCS基因片段和質粒pBIG2RHPH2進行酶切，并通過連接反應將MCS基因片段插入質粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位點之間得到質粒PBIG4。用融合PCR的方法獲得并連接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段。用限制性內切酶EcoRI和KpnI對敲除基因片段和質粒pBIG4進行酶切，并通過連接反應將敲除基因片段插入質粒PBIG4，得到重組質粒pBIG4K0ura5。將重組質粒pBIG4K0ura5轉化根癌農桿菌C58C1。借助 根癌農桿菌C58C1介導的基因同源重組打斷ura5基因，經過篩選鑒定得到高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株。
[0009]具體地，本發明提供一種高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株，該菌株是通過失活MortierellaalpinaATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的ura5基因構建而成的。
[0010]根據一種優選的實施方式，ura5基因的失活是通過缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而實現的。
[0011]本發明還提供一種制備權利要求1或2所述的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株的方法,通過同源重組使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失從而使ura5基因失活，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具體步驟為:首先獲得ura5敲除基因片段，并進一步構建敲除質粒pBIG4K0ura5，然后用重組質粒pBIG4K0ura5轉化根癌農桿菌，最后用經轉化的含質粒 pBIG4K0ura5 的根癌土壤桿菌 Agrobacterium tumefaciensC58Cl-pBIG4K0ura5(CGMCCN0.7730)轉化高山被孢霉并對轉化后的高山被孢霉進行篩選和鑒定，獲得尿嘧啶營養缺陷型菌株。
[0012]其中所使用的根癌農桿菌為:Agrobacterium tumefaciensC58Cl。此菌株獲贈于日本京都縣立大學YasuyukiKubo教授。[0013]基因敲除使用的根癌農桿菌起始載體為:pBIG2RHPH2。此載體獲贈于日本京都縣立大學Yasuyuki Kubo教授，其序列為SEQ N0.1。
[0014]根據一種優選的實施方式，基因敲除載體構建的具體步驟如下:
[0015]I)用PCR的方法獲得質粒pBluescript II SK+的MCS基因片段；
[0016]2)用限制性內切酶EcoRI和XbaI對MCS基因片段和質粒pBIG2RHPH2進行酶切，并通過連接反應將MCS基因片段插入質粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位點之間得到質粒PBIG4 ；
[0017]3)用融合PCR的方法獲得并連接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段；
[0018]4)用限制性內切酶EcoRI和KpnI對敲除基因片段和質粒pBIG4進行酶切，并通過連接反應將敲除基因片段插入質粒PBIG4獲得pBIG4K0ura5。
[0019]優選地，步驟3)中的敲除基因片段是通過下述步驟獲得的，
[0020]首先根據NCBI數據庫設計如下引物
[0021]Pl:GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC
[0022]P2:TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG
[0023]P3:TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT
[0024]P4:TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG
[0025]然后以高山被孢霉AT CC32222基因組為模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分別擴增上下游片段，再以上下游片段為模板，在反應體系中加入PU P4進行融合PCR反應，獲得K0ura5敲除基因片段。
[0026]更優選地,根據質粒pBluescriptIISK+的序列信息設計如下引物:
[0027]MCS 上游:TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
[0028]MCS 下游:AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG
[0029]然后用PCR的方法獲得步驟I)中的質粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。
[0030]所述的根癌農桿菌介導的基因敲除方法是采用根癌農桿菌轉化高山被孢霉，具體為:取100 μ L根癌農桿菌與100 μ L高山被孢霉孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙頂固體培養基上，進行轉化培養，然后篩選獲得高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株。
[0031]在本發明中，根癌農桿菌轉化高山被孢霉的具體步驟如下:
[0032](I)取保存于_80°C的含有質粒pBIG4K0ura5的根癌農桿菌C58C1于含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固體培養基平板劃線；30°C倒置避光培養48小時；
[0033]⑵挑取單克隆接種至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液體YEP培養基中30°C，200rpm避光培養24-48小時；
[0034]⑶4000g離心5分鐘收集菌體，倒掉上清，加5mUM培養基重懸菌體，4000g離心5分鐘，倒掉上清，加2mUM培養基重懸菌體；
[0035]⑷用頂培養基調整菌濃度至0D600=0.9，30°C，200rpm避光培養至O D 600 =
1.5 ；
[0036](5)收集高山被孢霉孢子，用血球計數器計數，調整孢子濃度到IO6個每100μ L ;
[0037](6)取100 μ L根癌農桿菌與100 μ L孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙頂固體培養基上，23°C避光培養48-96小時；
[0038](7)將玻璃紙轉移到含有100 μ g/mL壯觀霉素，100 μ g/mL頭孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上，25-30°C培養至產生大量孢子。
[0039]在本發明中，IM固體培養基是以組分 1.74g/LK2HP04,1.37g/LKH2P04,0.146g/LNaCl，0.49g/LMgS04.7Η20，0.078g/LCaCl2,0.0025g/LFeS04.7Η20，0.53g/L (NH4)2SO4, 7.8g/LMES, 1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油，20g/L瓊脂構成的。
[0040]本發明基于對高山被孢霉ATCC32222基因組生物信息學分析的基礎上，采用根癌農桿菌介導的基因敲除的方法，經過大量的實踐嘗試，構建了高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株。獲得的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株具有多次傳代的遺傳穩定性，且脂肪組分析結果與原養型菌株無明顯差別。該菌株可以作為基因工程的受體菌株使用。
[0041]本發明獲得的根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens C58C1-pBIG4K0ura5已于2013年06月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCCN0.7730。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0042]圖1為構建敲除質粒示意圖；
[0043]圖2為高山被孢霉OPRTase保守結構域分析示意圖；
[0044]圖3為融合PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
【【具體實施方式】】
[0045]以下通過實施例來進一步闡述本發明，下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊進行實驗操作。
[0046]實施例1:高山被孢霉ATCC32222基因組生物信息學分析
[0047]根據高山被孢霉ATCC32222 基因組信息(DDBJ/EMBL/GenBank accessionADAG00000000, first versionADAG01000000)預測的蛋白質編碼序列經 BLAST(E-valuelE-5)對蛋白數據庫 NR(www.ncb1.nlm.nih.gov),KOGs 和 COGs,KEGG, Swiss-Prot和UniReflOO, BRENDA搜索比對。使用InterProScan對蛋白質結構數據庫進行比對。預測得到編碼OPRTase的ura5基因coding序列全長654bp,其基因組序列無內含子。并根據ura5基因序列信息map高山被孢霉基因組序列，得到ura5基因以及上下游序列信息。
[0048]實施例2:K0ura5敲除基因片段的獲得
[0049]根據基因組生物信息學分析結果，針對OPRTase的蛋白質保守序列的活性位點(如圖2)，對ura5基因的DNA序列設計了包含不同長度的同源臂DNA序列敲除方案，以不同的長度和間距的上下游序列片段組合嘗試對ura5基因進行打斷。經過大量實踐和比較篩選過程確認，使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段時，能夠獲得以下成功實施案例。該成功案例的具體實施步驟如下:
[0050]首先，根據NCBI數據庫中設計引物
[0051]Pl:GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC
[0052]P2:TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG
[0053]P3:TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT
[0054]P4:TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG
[0055]引物P15'端引入EcoRI酶切位點；引物P45'端引入KpnI酶切位點。以高山被孢霉ATCC32222基因組為模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分別擴增上下游片段。切膠純化。再以上下游片段為模板，反應體系中加入P1、P4進行融合PCR反應，獲得K0ura5敲除基因片段，各PCR產物瓊脂糖凝膠電泳見圖3，Ml為D2000Marker，l號泳道為上游同源臂，2號泳道為下游同源臂，3號泳道為融合PCR產物，M2為lkbladderMarker。將基因克隆到pEGMT-easy 載體上，3730 測序。
[0056]實施例3:敲除質粒pBIG4K0ura5的構建
[0057]根據質粒pBluescriptIISK+的序列信息設計引物:
[0058]MCS 上游:TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
[0059]MCS 下游:AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG
[0060]用PCR的方法獲得質粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。
[0061]用限制性內切酶EcoRI和XbaI對MCS基因片段和質粒pBIG2RHPH2進行雙酶切，試劑盒回收后，使用T4連接酶連接。連接體系為(IOyL):MCS基因片段2yL，載體2yL，10XT4連接酶buffer I μ L，T4連接酶I μ L，無菌水41 μ L。4°C過夜連接。
[0062]連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態。轉化方法如下:
[0063]⑴無菌狀態下取100 μ L感受態細胞，加入1-2 μ L連接產物，混勻。
[0064]⑵將⑴中感受態移入電轉杯中，避免產生氣泡。
[0065]⑶將電轉杯放入Bio-Rad電轉儀，調到合適預設程序檔位，電轉。
[0066]⑷電轉后的感受態移至含有900 μ LSOC復蘇培養基的離心管中，37°C，150rpml小時。
[0067](5)取200 μ L涂布100 μ g/mL卡那霉素抗性YEP固體培養基平板。倒置37°C培養過夜。
[0068]挑取陽性轉化子，提取質粒，測序驗證，結果表明連接成功。獲得質粒PBIG4。
[0069]用限制性內切酶NheI和MunI，EcoRI和KpnI對敲除基因片段K0ura5和質粒pBIG4進行酶切，試劑盒回收后，使用T4連接酶連接，轉化T0P10感受態，挑取陽性轉化子，提取質粒，測序驗證，結果表明連接成功。獲得質粒pBIG4K0ura5。
[0070]其中，SOC復蘇培養基是以組分20g/LTryptOne，5g/L酵母粉，0.5g/LNaCl, 2.5mMKCl, IOmMMgCl2.20mM葡萄糖構成的；YEP固體培養基是以組分IOg/LTryptone, 10g/L 酵母粉,5g/LNaCl, 20g/L 瓊脂構成的。
[0071]實施例4:根癌農桿菌介導轉化高山被孢霉
[0072]在已有的國內外文獻有關根癌農桿菌轉化方法報道的基礎上，做了適當的優化調整，具體成功實施例如下:
[0073]⑴取保存于_80°C的含有質粒pBIG4K0ura5的根癌農桿菌C58C1于含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固體培養基平板劃線。30°C倒置避光培養48小時。
[0074]⑵挑取單克隆接種至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液體YEP培養基中30°C，200rpm避光培養24-48小時。
[0075](3) 4000g離心5分鐘收集菌體，倒掉上清。加5mUM培養基重懸菌體，4000g離心5分鐘，倒掉上清。加2mUM培養基重懸菌體。
[0076]⑷用頂培養基調整菌濃度至0D600=0.9。30°C，200rpm避光培養至0D600-1.5。
[0077](5)收集高山被孢霉孢子，用血球計數器計數，調整孢子濃度到IO6個每100 μ L。[0078](6)取100 μ L根癌農桿菌與100 μ L孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙頂固體培養基上。23°C避光培養48-96小時。
[0079](7)將玻璃紙轉移到含有100 μ g/mL壯觀霉素，100 μ g/mL頭孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上。25-30°C培養至產生大量孢子。
[0080]其中，液體YEP培養基是以組分lOg/LTryptone，10g/L酵母粉，5g/LNaCl構成的。
[0081]實施例5:高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株篩選和鑒定
[0082]⑴用3mL生理鹽水沖刷共培養的平皿表面，收集液體于一個無菌1.5mL離心管中。過25 μ m濾膜。
[0083]⑵分別取200 μ L涂布于含有lmg/mL5-F0A，100 μ g/mL壯觀霉素，100 μ g/mL頭孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上。
[0084](3)25°C避光培養 5_10 天。
[0085]⑷隨時用無菌鑷子挑出長出的真菌菌絲，接種于含有lmg/mL5-F0A，100 μ g/mL壯觀霉素，100 μ g/mL頭孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上。25°C避光培養2_4天。
[0086](5)將⑷中明顯生長的菌落分別接種到含有尿嘧啶和不含有尿嘧啶的SC固體平板上。
[0087]25 O 培養 2-4 天。
[0088](6)觀察在高山被孢霉兩種平板上的生長情況。挑出只在含有尿嘧啶的SC平板上生長的菌落，接種于含有0.5mg/mL5-F0A的GY斜面上。
[0089](7)將(6)中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在含有0.5mg/mL5-F0A的GY斜面上傳代3次，每一次傳代都重復步驟(5)中描述實驗。
[0090]⑶穩定遺傳的菌株鑒定為尿卩密唳營養缺陷型表型保藏于含有0.5mg/mL5-F0A的GY斜面上。
[0091]⑶提取具有尿嘧啶營養缺陷型表型高山被孢霉基因組。用引物:
[0092]上游:ATGACCATCAAGGATTACCAGCGCG
[0093]下游:ATCCTTAAACACCGTACTTCTCGCG
[0094]PCR獲得ura5基因，PCR產物純化后，測序，鑒定為213bp_230bp缺失的ura5基因。
[0095]實施例6:高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株脂肪組提取與檢測
[0096]⑴將高山被孢霉原養型菌株與實施例5篩選獲得的三株高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株接種于發酵培養基(營養缺陷型菌株需額外添加0.05g/L尿嘧啶)中，25°C，200rpm 培養 7-14 天。
[0097]其中，發酵培養基是購買自以組分50g/L葡萄糖，2.0g/LL-酒石酸銨，7.0g/LKH2PO4, 2.0g/LNa2HP04, 1.5g/LMgS04.7H20,1.5g/LYeast extract，。.lg/L CaCl2.2H20,8mg/LFeCl3.6H20, lmg/LZnS04.7H20,0.lmg/LCuS04.5H20,0.lmg/LCo (NO3) 2.6H20,0.lmg/LMnSO4.5H20 構成的。
[0098]⑵收集菌體，冷凍干燥。
[0099]⑶取IOOmg干重菌絲，加入2mL4mol/L鹽酸。
[0100](4) 80°C水浴0.5小時，-800C 15分鐘。重復一次。80°C水浴0.5小時。
[0101](5)冷卻至室溫,加入ImL甲醇,混勻。[0102](6)加入1mL氯仿，震蕩10分鐘。6000g離心3分鐘。收集氯仿。
[0103](7)重復(6)兩次。
[0104](8)合并氯仿(3mL)，加入ImL飽和氯化鈉，混勻，3000g離心3分鐘。收集氯仿層于新瓶。剩余液體加入ImL氯仿，3000g離心3分鐘。合并氯仿(4mL)。
[0105](9)氮吹干燥，加入ImL乙醚，轉移至潔凈的已經稱重的瓶中。氮吹干燥，稱重得到總脂肪重量。高山被孢霉原養型菌株與三株尿嘧啶營養缺陷型菌株總脂肪含量見表1。
[0106]表1、高山被孢霉原養型菌株與三株尿嘧啶營養缺陷型菌株總脂肪含量
[0107]
【權利要求】
1.一種高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株，其特征在于該菌株是通過失活Mortierella alpinaATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的ura5基因構建而成的。
2.根據權利要求1所述的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株，其特征在于:ura5基因的失活是通過缺失654bp的ura5基因中的213bp_230bp共18bp的序列而實現的。
3.一種制備權利要求1或2所述的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株的方法，其特征在于，通過同源重組使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失從而使ura5基因失活，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具體步驟為:首先獲得ura5敲除基因片段，并進一步構建敲除質粒pBIG4K0ura5，然后用重組質粒pBIG4K0ura5轉化根癌農桿菌，最后用經轉化的含質粒pBIG4K0ura5的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉并對轉化后的高山被孢霉進行篩選和鑒定，獲得尿嘧啶營養缺陷型菌株。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，其中所使用的根癌農桿菌為:Agrobacterium tumefaciensC58Cl。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，基因敲除使用的根癌農桿菌起始載體為:PBIG2RHPH2。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，基因敲除載體構建的具體步驟如下: 1)用PCR的方法獲得質粒pBluescriptII SK+的MCS基因片段； 2)用限制性內切酶EcoRI和XbaI對MCS基因片段和質粒pBIG2RHPH2進行酶切，并通過連接反應將MCS基因片段插入質粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位點之間得到質粒pBIG4 ； 3)用融合PCR的方法獲得并連接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段； 4)用限制性內切酶EcoRI和KpnI對敲除基因片段和質粒pBIG4進行酶切，并通過連接反應將敲除基因片段插入質粒PBIG4獲得pBIG4K0ura5。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)中的敲除基因片段是通過下述步驟獲得的， 首先根據NCBI數據庫設計如下引物
PI:GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC
P2:TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG
P3:TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT
P4: TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG 然后以高山被孢霉ATCC32222基因組為模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分別擴增上下游片段，再以上下游片段為模板，在反應體系中加入P1、P4進行融合PCR反應，獲得K0ura5敲除基因片段。
8.根據權利要求7所述的方法,其特征在于,根據質粒pBluescriptIISK+的序列信息設計如下引物:
MCS 上游:TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
MCS 下游:AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG 然后用PCR的方法獲得步驟I)中的質粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的根癌農桿菌介導的基因敲除方法是采用根癌農桿菌轉化高山被孢霉，具體為:取100 μ L根癌農桿菌與100 μ L高山被孢霉孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙頂固體培養基上，進行轉化培養，然后篩選獲得高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于根癌農桿菌轉化高山被孢霉的具體步驟如下: Cl)取保存于-80°C的含有質粒pBIG4KOura5的根癌農桿菌C58C1于含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固體培養基平板劃線；30°C倒置避光培養48小時； ⑵挑取單克隆接種至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液體YEP培養基中30°C，200rpm避光培養24-48小時； ⑶4000g離心5分鐘收集菌體，倒掉上清，加5mUM培養基重懸菌體，4000g離心5分鐘，倒掉上清，加2mUM培養基重懸菌體； ⑷用頂培養基調整菌濃度至0D600=0.9，30°C，200rpm避光培養至O D 600 = 1.5 ;(5)收集高山被孢霉孢子，用血球計數器計數，調整孢子濃度到IO6個每100μL ; (6)取100μ L根癌農桿菌與100 μ L孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙頂固體培養基上，23 °C避光培養48-96小時； (7)將玻璃紙轉移到含有100μ g/mL壯觀霉素，100 μ g/mL頭孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上，25-30°C培養 至產生大量孢子。
【文檔編號】C12R1/645GK103468581SQ201310347934
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】陳衛, 郝光飛, 陳永泉, 陳海琴, 黃小云, 杜凱, 趙山山, 張灝 申請人:江南大學