一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法
【專利摘要】本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法。所述培養基由麥芽糖、酵母浸粉、Ca2+維生素E組成。該方法通過將種子發酵液接種于培養基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量5%，于25℃，轉速140r/min下培養。本發明的發酵方法包括菌株活化、種子發酵液培養和發酵優化。本發明可大大提高淀粉酶產量。
【專利說明】一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法。
【背景技術】
[0002]淀粉酶(amylase)是水解淀粉和糖原酶類的統稱，是能夠將淀粉和糖原分子水解為糊精和更小的分子的一類酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中。淀粉酶廣泛應用于燃料乙醇、淀粉糖漿、傳統釀造、食品加工、紡織退漿等行業，是最早實現工業化生產，迄今為止用途最廣、產量最大的酶制劑品種之一。
[0003]雖然淀粉酶在動植物中都存在，但是由于提取過程復雜、成本較高，因此工業化比較困難。微生物來源的淀粉酶提取工藝簡單、成本低、產量高、
周期短、性質穩定、使用條件溫和，因此微生物來源的淀粉酶在工業上得到了廣泛應用，特別是在淀粉水解工業中，幾乎完全取代了傳統的化學水解法。
[0004]α -淀粉酶是指從淀粉分子內部隨機切割α -1, 4_糖苷鍵，生成糊精和還原糖的一類酶，由于生成的產物末端葡萄糖殘基C-1碳原子為α構型，故稱為α-淀粉酶。產α -淀粉酶的微生物很多，但是研究較多的主要是地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、放線菌、解淀粉芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉、假單胞菌等。由于蜂球囊菌生活周期短，能夠從其中快速得到α -淀粉酶，以適應工業化大生產和樣品提純，從而可以提高該菌的應用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法。
`[0006]本發明首先提供了一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法，其特征在于，所述培養基的原料含有:麥芽糖4g/100mL，酵母浸粉1-2 g/1OOmL, Ca2+3 X 10_3_6 X IO^mol/L, Ve 0.005-0.010 g/1OOmL, pH6.8-7.2。
[0007]優選為按重量分數計，麥芽糖4 g/100mL，酵母浸粉2 g/1OOmL, Ca2+6X 10_3mol/L，Ve 0.005 g/1OOmL, pH 7.0。
[0008]其次，本發明還提供了一種蜂球囊菌發酵產淀粉酶的方法，所述方法包含以下步驟:
(a)將實驗室所保存菌株轉接至固體培養基上進行平板活化；
(b)將蜂球囊菌接種于種子培養基，于25°C、轉速140r/min條件下培養培養3天，制得種子發酵液；
(c)將步驟(b)中制得的種子發酵液接種于權利要求1或2所述的培養基中，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量為5%，于25°C、轉速140 r/min條件下培養。
[0009]所述種子培養基PDA的原料含有:按培養基重量計，馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L。
[0010]本發明采用的蜂球囊菌(梁勤，陳大福，王建鼎.營養生態條件對蜜蜂球囊菌生長及產孢的影響.中國生態農業學報，2001，9(4): 31-34)。
[0011]采用本發明優化后的培養基，菌齡3d，發酵周期48h，發酵產生結果蜂球囊菌產淀粉酶為41.55U/mL以上。
[0012]本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌發酵生產淀粉酶的培養基，具有淀粉酶產率高，淀粉酶活力高，淀粉酶活性穩定以及重復性好等優點。
【具體實施方式】
[0013]本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。
[0014]實施例1
單因素實驗確定培養基最優成分
(I)種子培養基配制:馬鈴薯去皮，切塊，稱取200g，沸水煮30min，6層紗布過濾，稱取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至1000mL, pH自然。高壓滅菌121°C20min。
[0015](2)種子發酵液的制備:將蜂球囊菌接種于馬鈴薯瓊脂培養基上，于30°C下培養3d，待其產孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將蜂球囊菌菌塊(0.5X0.5cm)接種至種子培養基，25°C，轉速140 r/min下培養72h，即為種子發酵液。
[0016](3)將上述種子培養基按5%接種量接種至裝有50mL發酵培養基的三角瓶中(250mL)，25°C，轉速 140 r/min 下培養 48h。
[0017](4)酶液的制備:取步驟(3)中的發酵液在4°C下,5000 r/min離心，IOmin,得上清
液即為粗酶液，4°C保存，備用。
[0018](5)淀粉酶酶活測定:酶活測定方法采用DNS法。酶活定義為:50 °C，pH 7.5條件下每分鐘從可溶性淀粉中釋放I ymoL葡萄糖所需的酶量。
[0019]方法:采用DNS法測定還原糖的含量，方法是將底物(I %的淀粉溶液)，即將Ig淀粉溶于100 mL的pH 7.5, Tris - HCl緩沖液中加熱使其溶解。對照組(180 yL底物，加20 UL緩沖液，混勻)、樣品組(180 yL底物，加20 μ L步驟(4)所制得的酶液，混勻)。將樣品組、對照組均放入50 °C水浴鍋中保溫10 min，取出后各加200 μ L的DNS，沸水浴5 min后取出，用蒸餾水定容至2.5 mL，混勻后520 nm紫外光下測OD值。酶活計算公式:A =( [A1 — A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)
A——樣品酶活(u/mL) A1——樣品的吸光度值(OD520值)A0——空白對照的吸光度值
(OD520值校準為O) K-p-nitrophenol標準曲線的斜率
C0-p-nitrophenol標準曲線的截距N-稀釋倍數V1-反應液的體積(2.5 mL)
V2——酶液的體積(0.02 mL) t——反應時間(10 min)
(5)標準曲線的制作:
【權利要求】
1.一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的培養基及方法，其特征在于，所述培養基的原料含有:麥芽糖 4g/100mL，酵母浸粉 l_2g/100mL，Ca2+3 X 10_3_6 X 10_3mol/L，VE0.005-0.010g/100mL, ρΗ6.8-7.2。
2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述培養基的原料優選為按重量分數計，麥芽糖 4g/100mL，酵母浸粉 2g/100mL，Ca2+6 X l(T3mol/L，VE0.005g/100mL, pH7.0。
3.—種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟: (a)將實驗室所保存菌株轉接至固體培養基上進行平板活化。 (b)將蜂球囊菌接種于種子培養基，于25C、轉速140r/min條件下培養培養3天，制得種子發酵液； (c)將步驟(b)中制得的種子發酵液接種于如權利要求1所述的培養基中，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量為5%，于25°C ±1°C、轉速140r/min條件下培養。
4.如權利3所述一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的方法，其特征在于，所述種子培養基為PDA，其原料含有:按培養基重量計，馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L。
5.如權利3所述一種蜂球囊菌發酵高產淀粉酶的方法，其特征在于，步驟(c)的培養時間為2天。
【文檔編號】C12R1/645GK103509769SQ201310402428
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月7日 優先權日:2013年9月7日
【發明者】邱君志, 李小霞, 曹麗萍, 孟麗雪, 郭慶豐, 何肖云, 張以盼, 涂潔, 董冬, 姚靈丹 申請人:福建農林大學