一種利用甘蔗花葉病毒p3n-pipo構建的亞細胞定位試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用甘蔗花葉病毒P3N?PIPO構建的植物亞細胞定位試劑盒，包括4個分別標記綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白的胞間連絲定位載體：SCMV?P3N?PIPO?GFP、pSCMV?P3N?PIPO?RFP、pSCMV?P3N?PIPO?YFP和pSCMV?P3N?PIPO?CFP；4個無特異亞細胞定位的對照載體：pSAT6?EGFP?C1、pSAT6?ERFP?C1、pSAT6?EYFP?C1和pSAT6?ECFP?C1；限制性內切酶Xho I、Hind III、無RNase水和侵染液。使用本試劑盒可以快速明確目的基因表達產物是否具有胞間連絲定位的特性。
【專利說明】
-種利用甘薦花葉病毒P3N-PIPO構建的亞細胞定位試劑盒
技術領域 [0001] 本發明設及一種試劑盒，具體設及一種利用甘薦花葉病毒P3N-PIP0構 建的亞細胞定位試劑盒。本發明利用分別帶有綠色巧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)標記、紅色巧光蛋白（red fluorescent protein,RFP)標記、黃色巧光蛋白 (yellow fluorescent protein,YFP)標記和青色巧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP)標記的具有特異胞間連絲(Plasmodesma，PD)定位功能的蛋白SCMV-P3N-PIP0,指示待 驗證基因表達蛋白是否具有胞間連絲定位特性，屬于生物。
【背景技術】 [0002] 隨著生物技術的發展，尤其是基因組學的發展和測序技術的進步，越來 越多的新基因被發現，已經形成了海量數據。明確未知基因的功能，探討其潛在的應用價 值，是基因組學研究的終極目標。蛋白質是基因的表達產物，蛋白質的亞細胞定位與蛋白質 的結構和功能關系密切，蛋白質必須處于合適的位置才能發揮其功能。對于一個新基因，明 確其表達產物即蛋白質的亞細胞定位，可W為研究該基因的功能提供重要線索。目前，確定 蛋白質亞細胞定位的方法主要有Ξ種:細胞分饋法，電子顯微鏡分析，激光共聚焦法，其中 激光共聚焦法應用最為廣泛。激光共聚焦法利用標記巧光蛋白受激發產生的巧光信號，可 W直觀的觀察到目標蛋白所在的亞細胞位置。在對目標蛋白的亞細胞定位進行研究時，需 要陽性對照，即具有特異亞細胞地位的帶有可檢測標記的蛋白，佐證未知蛋白的定位。
[0003] 胞間連絲(Plasmodesma，PD)是植物體內穿過細胞壁連接相鄰細胞的細胞質和內 質網的連絲微管，是細胞間物質運輸與信息傳遞的重要通道。PD的結構極其復雜，至今依然 沒有完全清楚，其結構模型一直處于補充更新狀態。ro的通透性受多種因素調節，小分子物 質可W通過胞間連絲自由擴散，但是蛋白質、核酸等大分子或者大分子復合體如病毒粒子、 核糖體蛋白復合體等的胞間移動受PD的調控。對于植物胞間信號傳導和物質運輸等方面的 研究，盡管可W利用生物信息學手段對分離到的基因的編碼蛋白亞細胞定位進行預測，但 是必須對該基因編碼蛋白做亞細胞定位進行生物學實驗，明確其能否定位于PD，進而判定 該蛋白是否參與胞間信號轉導和物質運輸，為研究其功能提供直觀的實驗證據。
[0004] 2008年，Chung等利用生物信息學方法，對包括甘薦花葉病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高梁花葉病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘薦條紋花葉病毒 (Sugarcane sheak mosaic virus,SCSMV)等在內的48個馬鈴馨Υ病毒科的病毒分析表明， 在Ρ3基因內部存在一個保守結構G1-2A6-7，核糖體在該保守結構通過+2移碼可W翻譯出一個 大約6-7kDa的蛋白（ΡΙΡ0)，該蛋白與Ρ3蛋白的Ν端結合，形成一個大約25kDa的融合蛋白，即 P3N-PIP0。化ung等克隆了憲菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV)的P3N-PIP0編碼序 列，并通過實驗證實了化MV-P3N-PIP0定位于胞間連絲。研究表明，P3N-PIP0很可能是馬鈴 馨Y病毒的移動蛋白，該蛋白通過與寄主因子互作，使病毒通過胞間連絲實現胞間移動，進 而對寄主建立系統性侵染（Choi等，2005; Chung等，2008; Wen等，2010; Wei等，2010; Vijayapalani 等，2012)。但是有關 SCMV-P3N-PIP0，SrMV-P3N-PIP0 和 SCSMV-P3N-PIP0 的亞 細胞定位研究還未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種利用甘薦花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定 位試劑盒，為檢測目的基因表達產物是否定位于植物胞間連絲提供指示。
[0006] 為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下。
[0007] 利用融合PCR技術，WSCMV的P3基因編碼序列為模板，克隆了P3N-PIP0的編碼序 列，構建到攜帶不同巧光標記蛋白基因植物表達載體上，轉化農桿菌，注射本氏煙葉片，在 激光共聚焦顯微鏡下使用相應的激光激發并采集發射光信號，即可在本氏煙上皮細胞的胞 間連絲位置上觀測到清晰明亮的點狀圖像，證明了 P3N-PIP0定位于胞間連絲。據此，我們利 用SCMV的P3N-PIP0構建了植物亞細胞定位試劑盒。
[0008] 本發明的一種利用甘薦花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定位試劑盒，其特征在于 該試劑盒由下列試劑組成：
[0009] (1)綠色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存備用；
[0010] (2)紅色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存備用；
[0011] (3)黃色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存備用；
[0012] (4)青色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存備用；
[0013 ] (5)載體 PSAT6-EGFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存備用；
[0014] (6)載體 PSAT6-ERFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存備用；
[0015 ] (7)載體 PSAT6-EYFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存備用；
[0016] (8)載體 PSAT6-ECFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存備用；
[0017] (9)限制性內切酶趾0 1:1管，500units，100yL/管；
[001 引（10)限制性內切酶 Hind 111:1 管，500units，100yL/管；
[0019] (11)無 RNase 水:2瓶，lOOmL/瓶；
[0020] (12)侵染液：1管，50mL/管，-20°C冷凍保存備用；所述侵染液，包括D-葡萄糖， 250mg;MES，5ιΛ;Na3P〇4 · 12出0，5ιΛ;乙酷下香酬，如L加入dd出0至總體積50血。
[0021] 所述綠色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP的構建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-EGFP-Cl(GenBank:AY818374)進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 將酶切產物與插入片段S連接，并轉化至感受態大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗證；
[0022] 所述紅色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP的構建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-ERFP-Cl(GenBank:DQ005474)進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 與將酶切產物插入片段S連接，并轉化至感受態大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗證；
[0023] 所述黃色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP的構建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-EYFP-Cl(GenBank:AY818380)進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 將酶切產物與插入片段S連接，并轉化至感受態大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗證；
[0024] 所述青色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP的構建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-ECFP-Cl(GenBank:AY818374)進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 將酶切產物與插入片段s連接，并轉化至感受態大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗證；
[0025] 所述插入片段S，其核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核巧酸序列。
[0026] 本發明的優點和有益效果:使用本發明的試劑盒可W快速將目的基因構建到帶有 巧光標記的載體中，明確其表達產物是否具有胞間連絲定位的特性。本試劑盒提供了4種巧 光標記載體，為使用者提供了更多的選擇，滿足了研究不同基因表達產物是否共定位于胞 間連絲的需求。使用本試劑盒可W快速完成目的基因表達產物的亞細胞定位。
【附圖說明】：
[0027] 圖1為綠色巧光蛋白標記的載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP的質粒圖譜；
[002引圖2為紅色巧光蛋白標記的載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP的質粒圖譜；
[0029] 圖3為黃色巧光蛋白標記的載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP的質粒圖譜；
[0030] 圖4為青色巧光蛋白標記的載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP的質粒圖譜；
[0031 ] 圖5為擬南芥AtREMl. 3的紅色巧光蛋白標記載體pAtREMl. 3-RFP的質粒圖譜；
[0032] 圖6為pAtREMl. 3-RFP和PSCMV-P3N-PIP0-GFP亞細胞定位圖的合并圖片；
[0033] 圖7為GFP載體PSAT6-EGFP-C1的亞細胞定位；
[0034] 圖8為RFP載體PSAT6-ERFP-C1的亞細胞定位。
【具體實施方式】 [0035] 為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，W下結合實施例加 W 說明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。所述試劑和生物材料如 無特殊說明均可從商業途徑獲得。
[0036] 實施例一:SCMV-P3N-PIP0編碼序列的克隆
[0037] 本發明利用PCR技術，克隆了甘薦花葉病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)的P3 蛋白編碼序列；WP3基因為模板，利用融合PCR技術，克隆了SCMV的P3N-PIP0的編碼序列，并 將該序列連接到帶有不同巧光蛋白標記的表達載體中，獲得了 4個能夠特異定位于胞間聯 絲的亞細胞表達載體，即綠色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3NPIP0-GFP，紅色巧光蛋 白標記的PD定位載體PSCMV-P3NPIP0-RFP，黃色巧光蛋白標記的PD定位載體pSCMV- P3NPIP0-YFP和青色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3NPIP0-CFP。載體構建方法如下：
[0038] (1)SCMV-P3編碼序列的獲得:針對SCMV-P3的編碼序列設計特異PCR引物SCMV-P3- F(上游引物)和SCMV-P3-R(下游引物），W SCMV的cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR產物通過 瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得SCMV-P3的編碼序列。所述上游引物SCMV-P3-F的核 巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列；下游引物SCMV-P3-R的核巧酸序列為 序列表中SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列；SCMV-P3編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列；
[0039] (2) SCMV-P3N編碼序列的獲得:設計特異PCR引物，SCMV-P3N-F (上游引物)和SCMV- P3N-R(下游引物），在上游引物SCMV-P3N-F中引入酶切位點趾0 I。WSCMV-P3編碼序列為模 板，使用引物SCMV-P3N-F和SCMV-P3N-R進行PCR擴增，反應體系為25化：10 X PCR Buf f er 2.化L，dNTPs 2 . OyL，上游引物SCMV-P3N-F( ΙΟμL?ο 1/L) 1. OyL，下游引物SCMV-P3N-R( 10μ mo 1/L) 1.0化，Taq 酶（511/化)0.125化，d地2〇 17.37扣L，模板（cDNA) 1.0化，總體積 25化。PCR 反應程序：94°C預變性4min;然后運行35個循環，94°C30s，50°C30s，72°C Imin;最后72°C lOmiruPCR反應結束后，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收并濃縮至4(K)ngAiL， 獲得SCMV-P3N的編碼序列。所述上游引物SCMV-P3N-F的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列；下游引物SCMV-P3N-R的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:5所示的核 巧酸序列；SCMV-P3N編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列； [0040] (3) SCMV-PIP0編碼序列的獲得：設計特異PCR引物，SCMV-PIP0-F(上游引物）和 SCMV-PIP0-R(下游引物），在下游引物SCMV-P3N-R中引入酶切位點Hind III。WSCMV-P3編 碼序列為模板，使用引物SCMV-PIP0-F和SCMV-PIP0-R進行PCR擴增，反應體系為25化：10 X PCR Buffer 2.5化，dNTPs 2.0yL，上游引物SCMV-PIP0-F(10ymol/L)1.0yL，下游引物5〔1￥- PIP0-R (10皿01 /L) 1.0化，Taq酶（511/化)0.12 5化，d地2〇 17.3 7 扣L，模板 kDNA) 1.0化，總體 積25化。？〔3反應程序：94°C預變性4min;然后運行35個循環，94°C30s，50°C30s，72°Clmin; 最后72°C10minJCR反應結束后，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收并濃縮至 400ngAiL，獲得SCMV-PIP0的編碼序列。所述上游引物SCMV-PIP0-F的核巧酸序列為序列表 中56〇10^:7所示的核巧酸序列；下游引物5〔1￥斗1口〇-如勺核巧酸序列為序列表中56〇10 N0:8所示的核巧酸序列；SCMV-PIP0編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:9所示的 核巧酸序列；
[0041 ] (4)SCMV-P3N-PIP0編碼序列的獲得:將濃度均為40化g/化的P3N和PIP0的PCR產物 按照1:1混合作為模板，使用引物SCMV-P3N-F和SCMV-PIP0-R，利用融合PCR方法克隆SCMV- P3NPIP0編碼序列。PCR反應體系為25化：10XPCR Buffer 2.5^，(1ΝΤΡ3 2.0yL，上游引物 SCMV-P3N-F( 10ymol/L) 1. OyL，下游引物SCMV-PIP〇-R( 10ymol/L) 1. OyL，Taq酶（511/化） 0.12扣L，d地2〇 12.37扣L，模板（cDNA)6. OyL，總體積25化。PCR反應程序：94°C預變性4min; 然后運行35個循環，94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C Imin;最后72 °C lOmin JCR反應結束后，將PCR產 物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得SCMV-P3N-PIP0的編碼序列。所述SCMV-P3N- PIP0編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列；
[0042] (5)插入片段S的獲得:使用化0巧日化nd III對SCMV-P3N-PIP0編碼序列進行雙酶 切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得插入片段S;所述插入片段S的核 巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核巧酸序列；
[0043] (6)綠色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP的構建:使用趾0 I和 Hind III對載體pSAT6-EGFP-Cl(GenBank:AY818374)進行雙酶切，將酶切產物通過瓊脂糖 凝膠電泳進行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產物與插入片段S連接，并將連接產 物轉化至感受態大腸桿菌化schericMa coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗證，得到綠色巧光 蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP，其質粒圖譜如圖1所示；
[0044] (7)紅色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP的構建:使用趾0 I和 Hind III對載體PSAT6-ERFP-C1 (GenBank:DQ005474)進行雙酶切，將酶切產物通過瓊脂糖 凝膠電泳進行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產物與插入片段S連接，并將連接產 物轉化至感受態大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗證，得到紅色巧光 蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP，其質粒圖譜如圖2所示；
[0045] (8)黃色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP的構建:使用趾0 I和 Hind III對載體pSAT6-EYFP-Cl(GenBank:AY818380)進行雙酶切，將酶切產物通過瓊脂糖 凝膠電泳進行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產物與插入片段S連接，并將連接產 物轉化至感受態大腸桿菌化schericMa coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗證，得到黃色巧光 蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP，其質粒圖譜如圖3所示；
[0046] (9)青色巧光蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP的構建:使用趾0 I和 Hind III對載體pSAT6-ECFP-Cl(GenBank:AY818374)進行雙酶切，將酶切產物通過瓊脂糖 凝膠電泳進行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產物與插入片段S連接，并將連接產 物轉化至感受態大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗證，得到青色巧光 蛋白標記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP，其質粒圖譜如圖4所示；
[0047] 實施例二:擬南芥AtREMl .3的亞細胞定位
[004引 1、擬南芥AtREMl. 3基因的克隆
[0049] 從擬南芥中克隆了一個Remorin基因，將其克隆到克隆載體PMD19-T中。進化樹分 析表明該基因屬于Remorin基因家族的第1亞群的第巧中類型，命名為AtREMl. 3。文獻表明 Remorin可W定位于質膜和胞間連絲，但是生物信息學分析表明，Remorin沒有跨膜結構域 和信號膚。為驗證AtREMl. 3是否可W定位于胞間連絲，使用本試劑盒對其進行亞細胞定位 進行研究。所述AtREMl.3編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 12所示的核巧酸序 列；
[00加]2、亞細胞定位載體pAtREMl. 3-RFP的構建
[0051 ] (1)設計特異PCR引物，AtREM1.3-F(上游引物）和AtREM1.3-R(下游引物），在上游 引物AtREMl. 3-F中引入酶切位點化0 I，在下游引物AtREMl. 3-R中引入酶切位點化nd III。 使用該對引物，WAtREMl. 3基因的克隆載體為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為25化：10 XPCR Buffer 2.5^，(1ΝΤΡ8 2.0yL，上游引物AtREM1.3-F(10ymol/L)1.0yL，下游引物 AtREMl. 3-R(10皿01 /L) 1.0化，Taq酶巧U/化）0.125化，d地2〇 17.37扣L，模板（cDNA) 1.0化， 總體積25化。PCR反應程序:94°C預變性4min;然后運行35個循環，94°C 30s，50°C 30s，72°C Imin;最后72°ClOminePCR反應結束后，使用趾o巧日化nd III對PCR產物進行雙酶切，將酶 切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得插入片段InsTarget;所述上游引物 AtREM1.3-F的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:13所示的核巧酸序列；下游引物 AtREMl. 3-R的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 14所示的核巧酸序列；插入片段 Ins化rget的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 15所示的核巧酸序列；
[0化2] (2)取RFP對照載體，使用趾0 I和化nd III對載體PSAT6-ERFP-C1進行雙酶切，將 酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產物與插入片 段InsTarget連接，并將連接產物轉化至感受態大腸桿菌(^Escherichia coli )D冊α中，?兆取 陽性克隆驗證，得到紅色巧光蛋白標記的PD定位載體pAtREM1.3-RFP，其質粒圖譜如圖5所 示；
[0化3] 3、亞細胞定位實驗
[0054] (1)采用液氮凍融法，分別將亞細胞定位載體pAtREMl. 3-RFP和GFP標記的PD定位 載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP轉入感受態的農桿菌EHA105菌株中；在5mL LB培養基(含Rif，34μ g/rnL Kan，50yg/mL)中培養轉化的農桿菌，28 °C，200巧m培養過夜；
[0化日](2)常溫下，5,000巧m，離屯、5min，棄上清，加入ImL侵染液重懸菌液；
[0056] (3)重復步驟(2)，洗去培養基中含有的抗生素；
[0057] (4)加入ImL侵染液，現憶菌液0〇6日日，并調節0〇6日日值至0.1;
[005引（5)取75化L菌液于2mL無菌離屯、管中，混勻，放置3~化；將含有亞細胞定位載體 pAtREMl. 3-GFP的菌液和含有YFP標記載體的菌液等比混勻，進行侵染實驗；
[0059] (6)取健康本氏煙植株(在侵染前，光照處理煙草化），選擇兩片大的葉片，在煙草 葉片背面(兩個葉脈間)注射菌液并做好標記；
[0060] (7)把侵染過的煙草放在正常條件下培養。2天后取侵染葉片l-2cm2,背面朝上，用 激光共聚焦顯微鏡觀察。在采集巧光信號時，對同一個細胞分別采集不同巧光信號。待檢測 的pAtREM1.3-RFP標記的是紅色巧光蛋白，采集紅色巧光蛋白信號時，在箭頭所示位置會出 現亮點，表明AtREMl. 3在細胞膜上表達，但是無法確定其定位于PD;本試劑盒提供PD定位載 體PSCMV-P3N-PIP0-GFP標記的是綠色巧光蛋白，采集綠色巧光信號時，也會出現亮點，表明 亮點所在位置即為胞間連絲；當把兩張圖片合并時，紅色亮點和綠色亮點準確疊加后顯示 為黃色的亮點，表明AtREMl.3定位于胞間連絲，如圖6所示。
[0061 ] (8)按照上述程序和方法，將GFP載體PSAT6-EGFP-C1和RFP載體PSAT6-ERFP-C1在 本氏煙葉片表皮細胞中表達，激光共聚焦顯微鏡下檢測巧光信號。綠色巧光信號為散布狀 態（圖7)，紅色巧光信號為散布狀態（圖8)，表明綠色巧光蛋白和紅色巧光蛋白沒有特異的 亞細胞定位，目標蛋白的亞細胞定位不是綠色或紅色巧光蛋白引起的，由此，證明AtREMl.3 可W定位于胞間連絲。
[0062]所述瓊脂糖凝膠電泳，參照《分子克隆實驗指南》(第二版)第六章第一節中瓊脂糖 凝膠電泳的方法;所述將連接產物轉化至感受態大腸桿菌D冊α中，轉化方法參照《分子克隆 實驗指南》(第二版)第一章第五節中用氯化巧制備和轉化感受態大腸桿菌的方法;所述含 有陽性克隆的菌落的挑取，參照《分子克隆實驗指南》(第二版)第一章第六節中含重組質粒 的細菌菌落的鑒定方法;所述提取質粒DNA的方法，參照質粒提取試劑盒說明書;所述酶切 方法，參照限制性內切酶的說明書;所述回收方法，參照膠回收試劑盒說明書;所述用Τ4- DNA連接酶進行連接方法，參照T4-DNA連接酶操作說明書。
【主權項】
1. 一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定位試劑盒，其特征在于該試劑盒由 下列試劑組成： (1) 綠色熒光蛋白標記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-GFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存備用； (2) 紅色熒光蛋白標記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-RFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存備用； (3) 黃色熒光蛋白標記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-YFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存備用； (4) 青色熒光蛋白標記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-CFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存備用； (5) GFP 載體 pSAT6-EGFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存備用； (6) RFP 載體 pSAT6-ERFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存備用； (7) YFP 載體 pSAT6-EYFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存備用； (8) CFP 載體 pSAT6-ECFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存備用； (9) 限制性內切酶 Xho 1:1管，500units，100yL/管； (10) 限制性內切酶 Hind 111:1管，500units，100yL/管； (11) 無 RNase 水:2瓶，100mL/瓶； (12) 侵染液：1管，50mL/管，-20 °C冷凍保存備用。2. 根據權利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定位試劑盒， 其特征在于所述綠色熒光蛋白標記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-GFP的構建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-EGFP-Cl進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉化至感受態大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a中，挑取陽性克隆驗證;所述插入片 段S，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。3. 根據權利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定位試劑盒， 其特征在于所述紅色熒光蛋白標記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-RFP的構建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-ERFP-Cl進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉化至感受態大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗證;所述插入片段S，其核苷酸序列為 序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。4. 根據權利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定位試劑盒， 其特征在于所述黃色熒光蛋白標記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-YFP的構建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-EYFP-Cl進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉化至感受態大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗證;所述插入片段S，其核苷酸序列為 序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。5. 根據權利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構建的亞細胞定位試劑盒， 其特征在于所述青色熒光蛋白標記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-CFP的構建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-ECFP-Cl進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉化至感受態大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗證;所述插入片段S，其核苷酸序列為 序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/82GK105823889SQ201610217004
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月8日
【發明人】楊永慶, 程光遠, 彭磊, 徐倩, 董萌, 徐景升, 翟玉山, 鄧宇晴, 鄭艷茹, 高世武, 郭晉隆
【申請人】福建農林大學