功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明公開了一種功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧希鼮榻S素與氯化鋅組成的復(fù)合材料，平均直徑為100nm左右，姜黃素含量為97.77wt%，鋅離子含量為2.23wt%，形成姜黃素-Zn2+納米球形材料。本發(fā)明還公開了功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ā１景l(fā)明的基因?qū)氩牧暇哂休^高的轉(zhuǎn)染效率，在人乳腺癌細(xì)胞中可以達(dá)到40%左右；低毒性，姜黃素具有良好的生物相容性，細(xì)胞生存率很高；材料分散性良好，符合對轉(zhuǎn)染的要求；非常低的成本；材料制備反應(yīng)簡單易操作，可重復(fù)性好；應(yīng)用前景良好，可以應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制作中。
【專利說明】功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒?br> [【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及一種高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性的功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒ā?br> [【背景技術(shù)】]
[0002]隨著人類基因圖譜測定的完成，我們對人類疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識在基因水平上取得了突破性的進(jìn)展。目前研究表明，有許多疾病的發(fā)生及發(fā)展與基因密切相關(guān)。如果可以篩查出與疾病特異相關(guān)的基因片段或者基因突變，就可以有針對性地在基因水平上進(jìn)行特異治療，如通過導(dǎo)入相關(guān)缺失基因或沉默基因，以增強(qiáng)相關(guān)缺失功能或者沉默致病基因，從而達(dá)到徹底治療的目的。將目的基因安全有效地導(dǎo)入生物體內(nèi)是目前此研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵和難點(diǎn)。
[0003]基因?qū)胂到y(tǒng)或方法可以分為兩類:病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒為載體；非病毒型基因?qū)耄顼@微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀、陽離子脂質(zhì)體法、以及新興的納米基因?qū)氩牧稀Ｓ捎诓《拘突驅(qū)胂到y(tǒng)存在許多嚴(yán)重的不足，如病毒轉(zhuǎn)染有可能激活原癌基因等，故非病毒型轉(zhuǎn)染方式是目前的研究熱點(diǎn)，在上述非病毒式轉(zhuǎn)染中，顯微注射一次只能處理一個(gè)細(xì)胞；基因槍穿透力十分有限；磷酸鈣共沉淀法結(jié)果不穩(wěn)定；僅陽離子脂質(zhì)體法表現(xiàn)了良好的轉(zhuǎn)染效率，但是過高的毒性又限制了它的應(yīng)用。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒ǎ浠驅(qū)氩牧系纳锵嗳菪院茫矣傻投镜牟牧辖M成的復(fù)合材料，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上 述目的，本發(fā)明的功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧霞夹g(shù)方案為:一種功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧希鼮榻S素與氯化鋅組成的復(fù)合材料，平均直徑為IOOnm左右，姜黃素含量為97.77wt%,鋅離子含量為2.23wt%,形成姜黃素-Zn2+納米球形材料。
[0006]所述基因?qū)氩牧夏芎途G色熒光蛋白質(zhì)粒基因pGFP以非共價(jià)方式結(jié)合，形成無機(jī)納米基因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。
[0007]制備基因?qū)氩牧系姆椒òㄈ缦虏襟E:(1)取材料:氯化鋅，分析純，姜黃素，MW660，分析純，使用時(shí)無進(jìn)一步純化步驟；所有的制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5分鐘，然后雙蒸水清洗，并用洗液H20/HN03 (65%) /H2O2 (35%) (1:1:1，v/v/v)清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干；(2)材料的制備:用去離子水溶解氯化鋅制備0.lmmol/L,用無水酒精溶解姜黃素制備2mmol/L新制的姜黃素溶液；首先,在0.1mmol/L氯化鋅溶液中加入lml2mmol/L新制的姜黃素溶液,置于25mL的燒杯中，充分?jǐn)嚢?0min后，靜直I天，在8000r/m速度尚心，之后用雙蒸水洗至PH=7，最終樣品在室溫下晚干。
[0008]鋅離子的正電性本身可以用于基因轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率受溫度、濃度、操作環(huán)境等眾多因素影響，很不穩(wěn)定，將鋅離子固定在這種功能化的姜黃素-Zn2+表面，再與DNA中的鋅離子發(fā)生作用，可以達(dá)到更加穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率，并且也同時(shí)降低了高濃度鋅離子可能導(dǎo)致的活性，這將是其以后在體內(nèi)得到進(jìn)一步應(yīng)用的前提。
[0009]本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn):
[0010]1.具有較高的轉(zhuǎn)染效率，在人乳腺癌細(xì)胞中可以達(dá)到40%左右。
[0011]2.低毒性，姜黃素具有良好的生物相容性，細(xì)胞生存率很高。
[0012]3.材料分散性良好，符合對轉(zhuǎn)染的要求。
[0013]4.非常低的成本，姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種色素，價(jià)格低廉；另外實(shí)驗(yàn)中使用的化學(xué)藥品，如氯化鋅等都是常見易得的廉價(jià)試劑；
[0014]5.材料制備反應(yīng)簡單易操作，可重復(fù)性好。
[0015]6.應(yīng)用前景良好，可以應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制作中。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0016]圖1為本發(fā)明基因?qū)氩牧螩ur-Zn2+的掃描電鏡圖片。
[0017]圖2為轉(zhuǎn)染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖片。
[0018]圖3為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存率圖片。
[0019]圖4為細(xì)胞生存率圖。
[0020]圖5為轉(zhuǎn)染效率圖。
[0021]圖6為綠色瑩光蛋白(GFP)基因表之圖。
[【具體實(shí)施方式】]
[0022]一、本發(fā)明基因?qū)氩牧系闹苽?
[0023]1.取材料:主要材料:氯化鋅，分析純，Aldrich公司產(chǎn)品；姜黃素，MW660，分析純，使用時(shí)無進(jìn)一步純化步驟，Aldrich公司產(chǎn)品。所有的制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5分鐘，然后雙蒸水清洗，并用洗液H20/HN03 (65%) /H2O2 (35%) (1:1:1，v/v/v)清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干。
[0024]2.材料的制備:用去離子水溶解氯化鋅制備0.lmmol/L,用無水酒精溶解姜黃素制備2mmol/L新制的姜黃素溶液。首先,在0.lmmol/L氯化鋅溶液中加入lml2mmol/L新制的姜黃素溶液，置于25mL的燒杯中，充分?jǐn)嚢?0min后,靜置I天,在8000r/m速度離心,之后用雙蒸水洗至PH=7，最終樣品在室溫下晾干。參閱圖1分別為Cur-Zn2+的掃描電鏡SEM圖。
[0025]二、結(jié)合性能的測定
[0026]1、主要材料
[0027]綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP_Cl);HEPES平衡鹽溶液(自配);電泳緩沖液(0.5 X TBE,自配)；DNA上樣緩沖液；溴化乙啶(EB)。
[0028]2、主要方法
[0029]I μ LACC溶液(5mgACC溶解在 500 μ L雙蒸水中)與 I μ LpEGFP-CI 水溶液(0.1 μ g/μ L)以及8 μ I雙蒸水(pH=7.4water)在1.5mL離心管中混合，置于室溫下30分鐘讓其充分結(jié)合。Cur--Zn2+和 pEGFP-Cl 的質(zhì)量比分別用 100:1，50:1，30:1，10:1，1:1。在 5000rpm 的速度下離心5min。將沉淀物加載到1%的瓊脂糖(EB0.1 μ g/mL)在TAE的緩沖下，在IOOV電壓下跑40min，然后在320nm處觀察條帶。
[0030]3、結(jié)果
[0031]結(jié)果觀察，有多種條帶出現(xiàn)，這是因?yàn)閜EGFP-Cl有多種構(gòu)型所致。在質(zhì)量比10:1，I: I處條帶清晰明顯，說明在這些質(zhì)量比之下，DNA和納米顆粒結(jié)合不是很好，到了，100:1,50:1條帶消失，說明結(jié)合完全了。
[0032]這些結(jié)果表明:帶正電荷的pEGFP-Cl和Cur-Zn2+有一個(gè)最佳的結(jié)合比，超出50:1以后過多的納米顆粒顯得不再重要，所以使用50:1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0033]三、轉(zhuǎn)染
[0034]1、主要材料
[0035]人血管平滑肌細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞；ACC@pEGFP-Cl聯(lián)合體(上述制備);DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清FBS ；6孔培養(yǎng)板。
[0036]2、主要方法
[0037](I)細(xì)胞的培養(yǎng):將人乳腺癌細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計(jì)數(shù)后加入到6孔板中(5X IO6/孔)，用含F(xiàn)BS10%的DMEM溶液并加轉(zhuǎn)染優(yōu)化試劑培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%~70%的融合度。
[0038](2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):將培養(yǎng)好的細(xì)胞上清除去,換新的培養(yǎng)液并加入質(zhì)量比50:1的Cur-Zn2+OpEGFP-CI聯(lián)合體，培養(yǎng)48小時(shí)后分別對其熒光(圖3)、細(xì)胞存活率(碘化吡啶標(biāo)識，流式細(xì)胞儀檢測)(圖4)、轉(zhuǎn)染效率(流式細(xì)胞儀檢測)進(jìn)行測定。(圖5) [0039]3、結(jié)果分析
[0040]熒光圖可以看出有明顯綠色熒光，并且覆蓋面比較大。細(xì)胞生存率圖分別為無添加物、Cur-Zn2+OpEGFP-Cl 聯(lián)合體、Iipofectamine2000ipEGFP-Cl 聯(lián)合體的生存率，可以看到Cur-Zn2+OpEGFP-Cl聯(lián)合體對細(xì)胞生存率的影響是很小的。比lipofectamine2000@pEGFP-Cl聯(lián)合體的影響小很多。轉(zhuǎn)染效率圖可以看到Cur-Zn2+OpEGFP-CI聯(lián)合體可以達(dá)到約40%的轉(zhuǎn)染效率，這是在保證了細(xì)胞生存率的前提下達(dá)到了一個(gè)如此的轉(zhuǎn)染效率。雖然不及l(fā)ipofectamine2000高,但是其高細(xì)胞相容性是lipofectamine2000所無法比擬的。表現(xiàn)出了 Cur-Zn2+做為轉(zhuǎn)染試劑的巨大潛力。
【權(quán)利要求】
1.一種功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧希涮卣髟谟?它為姜黃素與氯化鋅組成的復(fù)合材料，平均直徑為IOOnm左右，姜黃素含量為97.77wt%,鋅離子含量為2.23wt%,形成姜黃素-Zn2+納米球形材料；其是根據(jù)下述方法制得:(I)取材料:氯化鋅，分析純，姜黃素，MW660，分析純，使用時(shí)無進(jìn)一步純化步驟；所有的制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5分鐘，然后雙蒸水清洗，并用洗液H20/HN03 (65%) /H2O2 (35%) (1:1:1，v/v/v)清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干；(2)材料的制備:用去離子水溶解氯化鋅制備0.lmmol/L,用無水酒精溶解姜黃素制備2mmol/L新制的姜黃素溶液；首先,在0.1mmol/L氯化鋅溶液中加入lml2mmol/L新制的姜黃素溶液,置于25mL的燒杯中，充分?jǐn)嚢?0min后，靜直I天，在8000r/m速度尚心，之后用雙蒸水洗至PH=7，最終樣品在室溫下晚干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧嫌糜诨蜣D(zhuǎn)染的用途，其特征為它能和綠色熒光蛋白質(zhì)粒基因PGFP以非共價(jià)方式結(jié)合，形成無機(jī)納米基因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧嫌糜诨蜣D(zhuǎn)染的用途，其特征為綠色熒光蛋白質(zhì)粒與姜黃素-Zn2+納米球形材料最佳的結(jié)合比為50:1。
4.一種功能化納米姜黃素的基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟冢ㄈ缦虏襟E: (O取材料:氯化鋅，分析純，姜黃素，MW660，分析純，使用時(shí)無進(jìn)一步純化步驟；所有的制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5分鐘，然后雙蒸水清洗，并用洗液Η20/ΗΝ03 (65%)/H2O2 (35%) (I:1:1, v/v/v)清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干； (2)材料的制備:用去離子水溶解氯化鋅制備0.lmmol/L，用無水酒精溶解姜黃素制備2mmol/L新制的姜黃素溶液；首先,在0.lmmol/L氯化鋅溶液中加入lml2mmol/L新制的姜黃素溶液，置于25mL的燒杯中，充分?jǐn)嚢?0min后，靜置I天，在8000r/m速度離心，之后用雙蒸水洗至PH=7， 最終樣品在室溫下晚干。
【文檔編號】C12N15/85GK103849650SQ201310479182
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】王深明, 張德元, 劉勇, 夏浩明, 周鴻雁, 李梓倫, 常光其, 徐安武 申請人:王深明, 徐安武, 張德元