Tert啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，屬于生物【技術領域】。TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，所述TERT啟動子的單核苷酸多態性序列為：TERT啟動子chr5,1,295,228位為C或T的堿基多態性序列；TERT啟動子chr5,1,295,242-1,295,243位為CC或TT的堿基多態性序列；TERT啟動子chr5,1,295,250位為C或T的堿基多態性序列。所述泌尿系統腫瘤為膀胱移行細胞癌或上尿路上皮細胞癌。本發明的優點在于首次在泌尿系腫瘤中發現TERT啟動子的高頻突變，為泌尿生殖系統腫瘤預后和監測的提供一種新的生物標志物。
【專利說明】TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用。
【背景技術】
[0002]膀胱癌是排在第九位的全球最常見的腫瘤。2013年，在美國有超過73000名患者被診斷為膀胱癌，其中死亡人數約15000人。其中超過90%的患者最初診斷為原發性膀胱癌，大約75%的患者目前為表淺膀胱腫瘤，20%的為浸潤性膀胱腫瘤，剩下的5%初診為轉移性腫瘤。先前的研究表明，膀胱癌有著多變的臨床表現和遺傳背景。最近的膀胱腫瘤研究報道了 8 個相關基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300, NCORl，ARID1A, CHD6)。
[0003]目前檢測“膀胱癌”采用的腫瘤標記物主要有以下幾種，但是各腫瘤標志物都存在不同的缺點:
(1)、膀胱腫瘤抗原(BTA):BTA試劑分為BTA stat和BTA test兩種；首先，這兩種試劑都不能獨立用于確診膀胱癌；另外，BTA試劑價格昂貴，目前尚難以全面推廣使用；
(2)、LewisX抗原檢測:Lewis X是ー種ABO血型相關抗原，在正常尿路上皮中不存在該抗原；而5%~89%的移行細胞癌可檢出Lewis X,但Lewis X與腫瘤的分級無關；
(3)、核基質蛋白22(nuclear matrix protein22,NMP22):NMP22是核有絲分裂器蛋白，診斷膀胱癌的敏感性為48%~90%，特異性為70%~92%，NMP22對高級，高期膀胱癌敏感性較高；
(4)、纖維蛋白/纖維蛋白降解產物(fibrindegradation products, FDP):用快速免疫檢測法測定尿中FDP診斷膀胱癌的敏感性為68%，對T2~T4期膀胱癌的敏感性更是高達100% ；
(5)、玻璃酸酶檢測hyaluronidase,HAase:玻璃酸酶是ー種細胞外降解基質透明質酸的內源性糖苷酶，在腫瘤進展中起重要作用，應用凝膠技術檢測G2，G3級膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性達92%~100% ；
(6)、端粒酶活性(telomerase):端粒是位于染色體末端的保護性結構，隨細胞分裂逐步縮短，直至細胞死亡，端粒酶的作用就是延長端粒，現已發現多種腫瘤細胞中端粒酶活性增強，該法診斷包括低級，低期腫瘤在內的膀胱癌，敏感性可達91%。
[0004]然而，導致膀胱腫瘤發生的關鍵點仍未完全闡明，同時由于這些個體標記的靈敏性較低以至于未被應用于臨床實踐中，這表明需要新的靈敏性高的生物標記。

【發明內容】

[0005]在本發明的試驗過程中，在超過85%的人類腫瘤研究中發現端粒酶逆轉錄酶(TERT, TERT通過Human Genome Browser獲取NCBI發布版本37的人類基因組序列:Feb.2009 (GRCh37/hgl9 ) ；>hgl9_ensGene_ENST00000310581_0 range=chr5:1295163-1296562 5’pad=400 3’pad=0 strand=- repeatMasking=none)活躍，我們認為是一個人類腫瘤發生的重要機制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5號染色體短臂，在人類腫瘤中調節端粒酶活性。最近人們應用全基因組測序在黑素瘤中發現TERT啟動子突變。人們在ー些膀胱癌樣本中證實了高頻率的TERT啟動子突變。ー些研究發現，具有活性的端粒酶或TERT表達增加與腫瘤的病理分期以及臨床分期是相關聯的。然而，人們還未獲得TERT基因拷貝，TERT的表達或活性對膀胱癌的臨床影響仍然是有爭議的。在本發明中，我們通過試驗得到TERT啟動子的高頻突變位點，并進行了相關的體外功能分析試驗來證實:這些啟動子的突變可提高ETRT活性，是導致惡性腫瘤發生的關鍵點所在，還分析了應用臨床病理因素來評估TERT基因作為早期癌癥檢測和預后的生物標記的作用，表明這些突變對泌尿生殖系統惡性腫瘤的診斷和預后具有重要的意義。
[0006]本發明的目的在于公開了 TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，所述TERT啟動子的單核苷酸多態性序列為:
TERT啟動子chr5，I, 295，228位為C或T的堿基多態性序列；
TERT啟動子chr5，I, 295，242-1，295，243位為CC或TT的堿基多態性序列；
TERT啟動子chr5，I, 295，250位為C或T的堿基多態性序列。
[0008]上述技術方案所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其中，所述泌尿系統腫·瘤為膀胱移行細胞癌或上尿路上皮細胞癌。
[0009]上述技術方案所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其中，所述應用包括下述步驟:
(1)、從樣本泌尿系統組織中提取DNA；
(2)、以包含TERT啟動子基因的待測基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增TERT啟動子基因，所述引物對P為:
TF:5，-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，，
TR:5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’ ；
PCR擴增完成后，對PCR產物進行sanger測序，當樣本中含有TERT啟動子的單核苷酸多態性序列時，該樣本為膀胱移行細胞癌或上尿路上皮細胞癌樣本。
[0010]上述技術方案所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其中，所述的PCR反應體系體積為20 iil，含有dNTP 2 u IUO X PCR Buffer 2 U I,TF(10 PM) I U I, TR(10 U M) Iii 1、模板 DNA IuU dH20 12.5 ii I 和 TaKaRa Taq HS
0.5 u I。
[0011]上述技術方案所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其中，所述的PCR擴增反應程序為:93°C 2分鐘預變性，然后按93°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，共40做個循環，最后72°C 7分鐘延伸。
[0012]本發明具有以下有益效果:
1、本發明為檢測膀胱癌提供一種新的腫瘤標志物，對發現膀胱癌及其相關疾病的易感人群和基因診斷有重要價值；2、本發明中的TERT啟動子的高頻突變可能膀胱癌發生的關鍵點所在，對探索膀胱癌等疾病的發病機制有重要意義；
3、本發明為臨床生物治療提供了分子靶向，同時也開辟新的治療途徑起到重要作用。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為通過ABI 3730 XL測序儀對PCR產物進行sanger測序得到的反鏈上體細胞突變位點；
圖2為PCR(RT-PCR)對TERT表達的分析結果，其中WT為野生型、C228T為正鏈chr5，I, 295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295，250 OT ；
圖3為蛋白免疫印記技術檢測TERT的表達分析結果，其中WT為野生型、C228T為正鏈chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；
圖4為染色質免疫共沉淀(ChIP)試驗檢測TERT表達分析結果，其中WT為野生型、C228T 為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；
圖5為劃痕愈合實驗檢測TERT啟動子突變對膀胱癌細胞的侵襲能力的結果，其中WT為野生型、C228T 為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；圖6為TERT啟動子突變和膀胱癌患者的病理因素分析結果圖。
[0014]【具體實施方式】:
為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發明TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用作進ー步的說明。
[0015]試驗例1:通過TERT啟動子的單核苷酸多態性序列檢測泌尿系統腫瘤:
一、樣本來源及選擇標準:
用中國泌尿生殖系統癌癥基因組學協會(UCGC)會員機構新診斷的泌尿系統癌癥病人的腫瘤組織作為實驗組，同時用患者的外周血或形態正常膀胱組織作為對照組。所有標本收集后用液氮快速冷凍并立即存儲在_80°C的環境中以用于更遠研究。由兩個獨立的病理學家在顯微鏡下評估由蘇木精-伊紅(HE)染色制備的癌組織切片。在本研究中，僅有腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織被用來提取DNA和進行隨后的測序。目前研究中總共有302位泌尿生殖系腫瘤患者參與測序，包括216名膀胱癌患者，11名腎盂癌患者，24名腎細胞癌患者，21名腎上腺腫瘤患者，17名睪丸癌患者及13名前列腺癌患者。
[0016]樣本的選擇標準:1、所有患者(302例)在術前都未經放療或化療；2、患者都是由中山腫瘤中心確診的；3、樣本組織都是新鮮組織，切下后30分鐘內放入RNAlater中，并在4° C冷藏過夜，其后-80° C低溫儲存；4、經HE染色，腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織；5、正常托腎組織在病理學檢查中顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細胞污染；6、年齡大于18歲。
[0017]二、主要試劑和儀器:
QIAamp DNA Mini Kits (試劑盒、希爾登，德國)；Dual 96-well GeneAmp PCRSystem 9700(美國，Life Technologies公司)；ABI 3730 XL測序儀(美國應用生物系統公司);TAKARATaqTM Hot Start (試劑盒、大連寶生物工程有限公司)。
[0018]三、操作步驟:
(一)、按照QIAamp DNA Mini Kits試劑盒中說明書的步驟對302例樣本(癌癥患者的腫瘤組織作為實驗組，同時用患者的外周血或形態正常膀胱組織作為對照組)中的DNA進行提取:
1、切割組織樣品，確定組織的數量，對于樣本組織的取材應在25mg以內。DNA產量與組織類型和大小有關，一般來說Img組織可得到大約0.2-1.2 ii g的DNA。
[0019]2、將切割下來的組織樣品切碎(step2a),研磨(step2b):
2a.將約25毫克的組織樣品切成小塊。放入ー個1.5ml離心管，并添加180 u I Buffer
ATL。[0020]2b.在將組織樣品置于液氮中，研磨磨徹底后倒入到1.5ml離心管。加入180 U IBuffer ATL0此過程中，液氮可以揮發，但組織不能融化。
[0021]3、加入20 ill proteinase K,振蕩處理20s, 56°C水浴至組織完全裂解。
[0022]注:proteinase K必須使用，因為QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情況下活性已降低。裂解時間視組織塊大小而定，通常l_3h即可完全裂解。過夜處理是合理的，無不良影響。為保證裂解效率，應使用振蕩水浴或者振蕩臺。
[0023]4、1.5毫升微型離心機短時離心，以去除離心管蓋內沿液體。
[0024]5、加入200 ill Buffer AL，振蕩15S，70°C水浴lOmin。1.5毫升微型離心機短時離心，以去除離心管蓋內沿液體。
[0025]加入Butter AL后，可能會產生白色沉淀物，70°C水浴中大都可以溶解。這些沉淀物對于抽提過程和后續實驗沒有影響。
[0026]6、加入200 U Iこ醇(濃度為96%_100%)，振蕩15s，1.5毫升微型離心機短時離心，
以去除離心管蓋內沿液體。加入こ醇后，可能會產生白色沉淀物。這些沉淀物對于抽提過程和后續實驗沒有影響。
[0027]7、仔細的將以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spincolumn中，將離心柱放入2ml收集管中。蓋緊離心管蓋，以6000Xg(8000rpm)離心lmin。將離心管取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)，丟棄舊的收集管與濾液。6000 Xg (8000rpm)離心是為了減少噪音，最大速度離心不影響DNA產量和純度。務必使所有溶液進入到收集管，如沒有，則需再次以更高速度離心直至所有溶液進入收集管。
[0028]8、小心加入 500 u I Buffer AWl 到 QIAamp Mini spin column 中，蓋緊離心管蓋，以6000Xg(8000rpm)離心lmin。將離心管取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中的慮液。
[0029]9、小心加入 500ii I Buffer AW2 到 QIAamp Mini spin column 中；蓋緊離心管蓋，以 20000 X g (14000rpm)離心 3min。
[0030]10、將QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自備)，丟棄舊的收集管與濾液。全速離心lmin。此步是為了防止Buffer AW2殘留。
[0031]11、將QIAamp Mini spin column置入一支潔凈1.5ml收集管中(自備)，丟棄舊的收集管與濾液。小心在QIAamp Mini spin column中加入200 u I Buffer AE或蒸懼水。室溫下靜置 lmin,6000Xg(8000rpm)離心 lmin。
[0032]12、重復step 11之離心操作。將收集管蓋好，保存于_20°C，此時收集管中為腫瘤和正常対照的DNA。
[0033](二)、PCR 引物設計:
針對TERT核心啟動子序列設計引物,用primer5.0設計引物:TF: 5， -CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，；
TR: 5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’。
[0034](三)、進行PCR擴增:利用Dual 96-well GeneAmp PCR System 9700 (美國，LifeTechnologies公司)PCR擴增儀,用步驟(二)中相同的引物擴增從步驟(一)中獲得的DNA模板，.按照TAKARATaqTM Hot Start PCR試劑盒的說明書要求擴增出啟動子片斷:
(1)、按表1中的組份配制PCR反應體系(在冰上進行反應體系的配制)。
[0035]表1PCR反應體系
【權利要求】
1.TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，所述TERT啟動子的單核苷酸多態性序列為: TERT啟動子chr5，I, 295，228位為C或T的堿基多態性序列； TERT啟動子chr5，I, 295，242-1，295，243位為CC或TT的堿基多態性序列； TERT啟動子chr5，I, 295，250位為C或T的堿基多態性序列。
2.根據權利要求1所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其特征在于:所述泌尿系統腫瘤為膀胱移行細胞癌或上尿路上皮細胞癌。
3.根據權利要求1或2所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其特征在于，所述應用包括下述步驟: (1)、從樣本泌尿系統組織中提取DNA； (2)、以包含TERT啟動子基因的待測基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增TERT啟動子基因，所述引物對P為:
TF:5，-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，，
TR:5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’ ； PCR擴增完成后，對PCR產物進行sanger測序，當樣本中含有TERT啟動子的單核苷酸多態性序列時，該樣本為膀胱移行細胞癌或上尿路上皮細胞癌樣本。
4.根據權利要求3所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其特征在于，所述的PCR反應體系體積為20 iil，含有dNTP 2 u IUO X PCR Buffer2 U I ,TF(10 PM) I u 1,TR(10 U M) Iii 1、模板 DNA I U UdH2O 12.5 ii I 和 TaKaRa TaqHS 0.1。
5.根據權利要求3所述的TERT啟動子的單核苷酸多態性序列在檢測泌尿系統腫瘤中的應用，其特征在于，所述的PCR擴增反應程序為:93°C2分鐘預變性，然后按93°C I分鐘，550C I分鐘，72°C I分鐘，共40做個循環，最后72°C 7分鐘延伸。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571954SQ201310514819
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】吳松, 黃毅, 王波, 蔡志明, 梅紅兵 申請人:深圳市第二人民醫院