人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（ngal）的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種在畢赤酵母中制備人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（NGAL）的方法，包括如下步驟：提供編碼NGAL的核苷酸序列；將所述NGAL的核苷酸序列克隆到不同的酵母表達載體中；將所述酵母表達載體轉化至同一酵母宿主；誘導所述酵母宿主表達C端帶有組氨酸標簽的NGAL；純化經步驟（4）處理后的NGAL。該方法表達量高，表達產物無需經過變性和復性，即可得到有活性的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（NGAL），并且后續的純化步驟也簡單方便。制備的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（NGAL）可用于檢測急性腎損傷的NGAL檢測試劑盒。
【專利說明】人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因重組人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，具體地說，涉及一種在酵母中制備重組人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的方法。
【背景技術】
[0002]一、人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)[0003]人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白NGAL(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin)為Iipocalin (載脂蛋白)家族的一個新成員，是Kjeldsen等人1993年在研究中性粒細胞明膠酶,基質金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9 ;即明膠酶B)時發現的。隨后，NGAL cDNA及其全基因序列分別于1994和1997年被克隆鑒定。NGAL蛋白由一條多肽鏈構成，其分子量為25kD的糖蛋白，含有178個氨基酸殘基。多肽鏈由N端的310-螺旋、C端的α螺旋和中間的八段反平行式β折疊構成了一個lipocalin家族特有的β折疊桶結構。NGAL既能夠自身聚合形成46kD的同源二聚體，也能夠與MMP-9聚合形成135kD的異源二聚體。在中性粒細胞中NGAL和MMP-9既有獨立存在的方式，又有聯合存在的方式。這提示NGAL和MMP-9既可以獨立發揮作用，又可以相互結合在一起聯合發揮功能。
[0004]NGAL參與多樣的生化過程，涉及胚胎發育、細胞分化、炎癥免疫應答、細胞凋亡、月旨質代謝、腫瘤的發生發展，特別是腫瘤的浸潤轉移等等。其主要功能為:1)參與炎癥與天然免疫反應；2)保護調芐基質金屬蛋白酶-9的活性；3)作為一種新型的鐵離子轉運載體，介導新的獨特的跨膜轉鐵通路等等。此外，NGAL可能是人類的一種十分重要的癌蛋白，與食管癌等腫瘤密切相關。近年來，隨著NGAL蛋白在人體組織細胞中廣泛分布的認識，特別是在一些腫瘤組織細胞中該基因異常過度表達的發現，有關NGAL蛋白新功能的研究呈現出活躍發展趨勢。
[0005]二、基因重組方法制備NGAL
[0006]傳統方法從病人尿液中提取NGAL具有難以克服的缺點，例如:得率很低；批間差很大；存在生物安全隱患，難于工業化生產等。而基因工程方法來表達，生產重組蛋白質不會存在這些問題。最常用的基因工程蛋白表達系統包括大腸桿菌和酵母系統。
[0007]1、大腸桿菌表達系統
[0008]在各種表達系統中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統，也是目前掌握最為成熟的表達系統。其主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG等誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。
[0009]對于表達不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種。非融合表達是將外源基因插到表達載體強啟動子和有效核糖體結合位點序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達產物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達是將目的蛋白或多肽與另一個蛋白質或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內表達。融合型表達的載體包括分泌表達載體、帶純化標簽的表達載體、表面呈現表達載體、帶伴侶的表達載體。
[0010]作為發展最早、目前應用最廣泛的經典表達系統，大腸桿菌表達系統優點在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等。但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點:如目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。
[0011]大腸桿菌系統表達重組蛋白的操作步驟包括:
[0012]I)目的基因的取得:目的基因可以從適當的供體生物包括微生物、動物或植物中提取，也可以由化學合成法合成有特定功能的目的基因。
[0013]2)載體系統的選擇:一個優良的載體必須具備幾個條件:是一個具自我復制能力的復制子；能在受體細胞內大量增值；只有一個限制性內切核酸酶的切口 ；其上必須有一種選擇性遺傳標記。對于大腸桿菌表達系統來說，載體主要是一些松弛型細菌質粒。
[0014]3)目的基因與載體DNA的重組:采用限制性內切酶處理產生粘性末端，經過退火后在連接酶的作用下，目的基因就與載體DNA結合形成重組載體。
[0015]4)重組載體導入受體細胞:在大腸桿菌表達系統中通過轉化法將質粒導入受體細胞，如CaCl2轉化法，電穿擊法、熱擊法等。
[0016]5)重組菌株的篩選鑒定:對表達的重組菌株進行抗生素篩選，電泳鑒定后才能大規模培養。
[0017]6)重組菌株的大規模培養:通過在搖瓶及發酵罐上采用單因子及正交試驗進行條件的優化，在最佳培養條件下大規模發酵。
[0018]7)重組蛋白的分離純化:常用的有離子交換層析、凝膠層析、親和層析、膜分離等方法，或將幾種方法聯合起來。
[0019]2、酵母表達系統
[0020]酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用。最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母。但與新型酵母體系相比，釀酒酵母表達系統存在不適合高密度培養、缺乏強有力的嚴格調控的啟動子，而且分泌效率較低，尤其是許多分子量大于30kD的外源蛋白幾乎不分泌等缺點，通常不被看作是重組蛋白的理想宿主。后來人們又相繼開發了裂殖酵母、甲醇酵母
坐寸ο
[0021]甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha, Candida Bodini,Pichia Pastris3 種，并以 Pichia Pastoris 應用最多。甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOXl)，在該基因的啟動子(PAOXl)作用下，外源基因得以表達。PAOXl是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOXl基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時PAOXl可被誘導激活，因而外源基因可在其控制下表達，將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產量。甲醇酵母一般先在含甘油的培養基中生長。培養至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。[0022]酵母系統表達重組蛋白的操作步驟包括:
[0023]I)目的基因的克隆:選用合適的限制性內切酶將外源基因克隆于表達載體的多克隆位點。如果選用的是分泌型表達載體，則外源基因的閱讀框架和信號肽的閱讀框架應該
保持一致。
[0024]2)重組載體線性化:重組載體只有被酶切線性化，整合效率才能大大提高，環狀質粒整合效率是很低的。選用不同的內切酶線性化可得到不同的轉化子。
[0025]3)酵母轉化:電穿孔，原生質球，PEG，或醋酸鋰，選用上述四種方法中的任何一種轉化。一般選用原生質球或電穿孔，因為這兩種方法轉化效率較高。
[0026]4)篩選:轉化子可先在不含組氨酸的培養基上初篩。復篩可用PCR進行。即提取轉化子DNA，用外源基因兩側特異引物擴增篩選。然而，這只限于少量轉化子。轉化子太多，則工作量太大。對于大量轉化子的篩選，可用原位點雜交進行。
[0027]5)鑒定表型:篩選出的轉化子需鑒定表型，即確定是Mut,還是Muts。這兩種不同表型在誘導表達的條件上有差異。可以把轉化子同時點在MD和MM兩種平板上。在MD和MM平板上生長差別不大的轉化子為Mut+ ;相反，在MD上生長快，MM上生長很慢的轉化子為Muts0
[0028]6)誘導表達:外源蛋白在甲醇酵母中的表達分兩步，即菌體生長和蛋白誘導表達。先在以甘油為碳源的培養基上培養菌體，達到一定OD值后，離心棄上清，菌體懸浮于以甲醇為碳源的培養基中誘導表達。每隔一段時間加一次甲醇，以彌補甲醇的損失。表達的條件有待優化，如通氣狀況，PH值，培養基的組成等等。一旦最佳條件確定，則可以按比例放大，從搖瓶培養轉至大規模發酵。
[0029]國內外已有運用大腸桿菌(原核系統)和酵母細胞來表達NGAL的文章和專利。王小中等人(NGAL原核表達及多克隆抗 體的制備，國際檢驗醫學雜志，2011，32(16):1789-1791)把NGAL基因克隆到pet28a載體，在大腸桿菌中表達該蛋白。但實際上由于大腸桿菌系統缺乏翻譯后的糖基化修飾，NGAL的表達產物為非糖基化蛋白。而NGAL本身為糖蛋白，糖基對蛋白有保護作用。汕頭大學醫學院李恩民等人(重組畢赤酵母及其表達NGAL蛋白的方法，專利申請號:200610123677.X)在畢氏酵母菌中表達了 NGAL，表達產物為糖蛋白，具有生物學活性。該專利利用酵母表達載體PPIC9，表達量大于100mg/L。但在菌落篩選時，只采用了菌落PCR方法，如果篩選表達量更高的重組菌株，需要從成百甚至上千個重組菌株才能篩選出來，此外，即使是用G418篩選，當菌落密度高時，會產生很多假陽性；而且，其在蛋白純化時，純化繁瑣，需要經過硫酸銨沉淀，脫鹽，陽離子交換等等。

【發明內容】

[0030]本發明的目的是提供一種生物活性高，表達量高，菌落篩選更為簡單且雜蛋白少純化更為簡便的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法。
[0031]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0032]一種人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其包括如下步驟:
[0033](I)提供編碼NGAL的核苷酸序列；
[0034](2)將所述NGAL的核苷酸序列克隆到不同的酵母表達載體中；
[0035](3)將所述酵母表達載體轉化至同一酵母宿主；[0036](4)誘導所述酵母宿主表達C端帶有組氨酸標簽的NGAL ；
[0037](5)純化步驟(4)處理后的NGAL。
[0038]所述人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所
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[0039]所述酵母表達載體為能夠用以表達外源蛋白的穿梭載體。
[0040]優選的是，所述酵母表達載體為pPICZ α B。
[0041]所述酵母宿主為漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母或光滑球擬酵母中的任意一種。
[0042]優選的是，所述酵母宿主為畢赤酵母。
[0043]優選的是，所述組氨酸標簽是含有六個連續的組氨酸的氨基酸序列。
[0044]優選的是，所述步驟(4)中的誘導表達使用甲醇作為唯一碳源，并使甲醇的終濃度為發酵液體積的0.5%~3% (V/V)0
[0045]優選的是，所述步驟(5)中的純化操作在Ni2+-NTA基質中進行，并采用咪唑溶液進行洗脫。
[0046]本發明的有益效果為:
[0047]1.在酵母真核表達系統中進行重組表達，表達產物NGAL無需變性和復性，誘導表達后收集培養基上清即可得到有活性的NGAL。
[0048]2.表達量很高，雜蛋白 很少。表達量可達至少150mg/L (搖瓶中)，即使不純化，蛋白純度可達80%以上。預計在發酵罐中，由于通氣量，甘油，甲醇含量更容易得到控制，表達量可以至少比搖瓶中提高4倍以上。
[0049]3.表達生成C端帶有組氨酸標簽(His tag)的NGAL，使得在后續的親和層析過程中，只需一步純化步驟即可得到純品。
[0050]4.如根據酵母偏好密碼子提供編碼的NGAL的核苷酸序列，還可以進一步提高表達量。
[0051]5.如在誘導表達過程中使甲醇的終濃度達到0.5%至3% (V/V)，能夠更高效的表達 NGAL。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1為NGAL在酵母中的誘導表達結果示意圖，其中泳道M為蛋白質分子量標準，泳道1-5為不同重組轉化子X-33/pPICZ a B-NGAL誘導表達3天的上清；
[0053]圖2為重組NGAL的純化結果示意圖，其中泳道M為蛋白質分子量標準，泳道1、2為NGAL親和層析產物；
[0054]圖3為重組NGAL的免疫學活性測定結果示意圖，其中泳道M為蛋白質分子量標準，泳道I為NGAL，泳道2為對照。
【具體實施方式】
[0055]材料:
[0056]菌株和質粒:克隆菌種Escherichia coli (DH5a)是基因工程常用工具菌種；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS_115、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)KM_71、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) KM-71H、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) X-33、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) SMD-1168、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) SMD-1 168-H ;質粒pPICZ a B購于invitrogen公司。
[0057]酶和試劑:
[0058]實施例中涉及分子生物學操作所用的酶均購于北京經科宏達公司。
[0059]PCR純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒(全式金)、酵母DNA提取試劑盒均購于北京天根公司(TianGen)。
[0060]NGAL兔源多克隆抗體(H-130)購于santa公司，驢抗兔帶HRP標記的二抗購于北京博奧森生物技術有限公司。
[0061]實施例中所涉及的編碼NGAL的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的測序工作由賽諾基因完成。
[0062]抗生素zeocin 購于 invitrogen 公司。
[0063]培養基如下:
[0064]LB培養基、Amp抗性LB培養基、YPD培養基、MD培養基、zeocin抗性YPD培養基以上培養基為液體培養基；
[0065]zeocin-YPD固體培養基、BMGY培養基、BMMY培養基；
[0066]以上培養基是基因工程領域常用培養基，各培養基的配方可參見分子克隆第三版下冊附錄2以及invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(Mult1-Copy Pichia ExpressionKit)第 64 頁-第 70 頁；及 pPICZ α A, B, and C 第 17-第 18 頁。
[0067]實施例1
[0068]本實施例人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其包括如下步驟:
[0069]UpPICZa B-NGAL表達載體的構建
[0070](1 )NGAL全基因合成:按照畢赤酵母密碼子偏好性化學合成NGAL基因的核苷酸序列，最終基因為SEQ ID NO:1所示的堿基序列。
[0071](2)以上述合成的堿基序列作為模板，以設計的三條引物為上下游引物，進行巢式PCR擴增，其中首次PCR所需引物如下:
[0072]上游引物NGAL-Ul (下劃線為5’ His):
[0073]GAAGCTCATCACCACCATCACCATCAAGACTCCACCTCTGACTT
[0074]下游引物NGAL-R (下劃線為NotI位點):
[0075]TTCTTGCGGCCGCTTATCAACCGTCGATACATTGGTCGA
[0076]首次PCR反應體系為:
[0077]
【權利要求】
1.一種人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟: (1)提供編碼NGAL的核苷酸序列； (2)將所述NGAL的核苷酸序列克隆到pPICZα B酵母表達載體中； (3)將所述酵母表達載體轉化至同一酵母宿主； (4)誘導所述酵母宿主表達C端帶有組氨酸標簽的NGAL； (5)純化經步驟(4)處理后的NGAL。
2.根據權利要求1所述的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求1所述的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述酵母宿主為漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母或光滑球擬酵母中的任意一種。
4.根據權利要求3所述的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述酵母宿主為畢赤酵母。
5.根據權利要求4所述的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述畢赤酵母為Χ-33或G-115。
6.根據權利要求1所述 的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述組氨酸標簽是含有六個連續的組氨酸的氨基酸序列。
7.根據權利要求1所述的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中的誘導表達使用甲醇作為唯一碳源，并使甲醇的終濃度為0.5%~3%(V/V)。
8.根據權利要求1所述的人中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)的制備方法，其特征在于，所述步驟(5 )中的純化操作在Ni2+-NTA基質中進行，并采用咪唑溶液進行洗脫。
【文檔編號】C12N15/12GK103880948SQ201410040897
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2013年4月11日
【發明者】彭毅, 翟文, 龐朋沙 申請人:北京愛必信生物技術有限公司