S腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahh）的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種在畢赤酵母中制備S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的方法，包括以下步驟：提供編碼S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的核苷酸序列；將所述S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的核苷酸序列克隆到酵母表達載體中；將所述酵母表達載體轉化至同一酵母宿主；誘導所述酵母宿主表達N端帶有組氨酸標簽的S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）；純化所述N端帶有組氨酸標簽的S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）。該方法表達工藝簡單，表達產物無需經過變性和復性，即可得到有活性的S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH），并且后續的純化步驟也簡單方便。制備的S腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）可用于檢測心血管疾病的同型半胱氨酸檢測試劑盒。
【專利說明】S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因重組S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，具體地說，涉及一種在酵母中制備重組S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的方法。
【背景技術】
[0002]1、S 腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH, Adenosylhomocysteinase)
[0003]同型半胱氨酸(Hcy)為含巰基氨基酸，是體內甲硫氨酸循環過程中的一個代謝中間產物。血液中總Hcy濃度的病理性升高會導致高同型半胱氨酸血癥。近年來的研究已確認，高同型半胱氨酸血癥與作為人類第一殺手的動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等多種心血管疾病的發生有密切關系，是心血管疾病的一個新的獨立和重要的危險因素。目前國內外已經把Hcy作為心血管疾病的一個檢測指標。
[0004]Hcy檢測方法中最快捷、靈敏度高、適合大批量樣品檢測，并且可以上生化分析儀自動分析的是Hcy檢測試劑盒。其中最常用的是循環酶法試劑盒，試劑盒中最核心的酶是Hcy甲基轉移酶(HMT)和S腺苷同型半胱氨酸水解酶。游離型Hcy與共價底物S-腺昔甲硫氛酸(S-Adenosyl Methionine, SAM)在同型半胱;氛酸甲基轉移酶(HomocysteineMethyltransferase, HMT)的催化下反應，形成甲硫氨酸(Met)和S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosyl Homocysteine, SAH), SAH被S腺苷同型半胱氨酸水解酶水解成腺苷(Ado)和Hcy，形成的Hcy可以循環加入反應，從而放大檢測信號。這些反應被用來研發同型半胱氨酸檢測試劑盒。
[0005]2、基因重組方法制備SAHH
[0006]傳統方法從動物體內提取SAHH具有難以克服的缺點，例如:得率很低；批間差很大；存在生物安全隱患，難于工業化生產等。而基因工程方法來表達，生產重組蛋白質不會存在這些問題。最常用的基因工程蛋白表達系統包括大腸桿菌和酵母系統。
[0007]( I)大腸桿菌表達系統
[0008]作為發展最早、目前應用最廣泛的經典表達系統，大腸桿菌表達系統優點在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等。但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點:如目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。
[0009](2)酵母表達系統
[0010]酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用。最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母。但與新型酵母體系相比，釀酒酵母表達系統存在不適合高密度培養、缺乏強有力的嚴格調控的啟動子，而且分泌效率較低，尤其是許多分子量大于30kD的外源蛋白幾乎不分泌等缺點，通常不被看作是重組蛋白的理想宿主。后來人們又相繼開發了裂殖酵母、甲醇酵母等。[0011]甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha, Candida Bodini,Pichia Pastris3 種，并以 Pichia Pastoris 應用最多。甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOXl)，在該基因的啟動子(PAOXl)作用下，外源基因得以表達。PAOXl是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOXl基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時PAOXl可被誘導激活，因而外源基因可在其控制下表達，將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產量。甲醇酵母一般先在含甘油的培養基中生長。培養至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。
[0012]國內外已有SAHH表達的文章和專利。徐明旭等人(高特異性活性重組S-腺苷高半胱氨酸酶的制備與高度表達及對S腺苷甲硫氨酸的改進分析，專利申請號:01803726.7)在大腸桿菌中表達了滴蟲來源的SAHH基因。該基因表達產物含485氨基酸，大小為56kD左右。表達產物能特異地將S腺苷同型半胱氨酸水解為腺苷和同型半胱氨酸，具生物學活性。
[0013]金曉霞等人(黃瓜S-腺苷L-高半胱氨酸水解酶全長cDNA的克隆及表達分析)克隆了黃瓜SAHH cDNA基因，該基因編碼485個氨基酸，分子量55kD左右。該基因和蛋白的生物學特征分析表明:該蛋白分別在85-99氨基酸和262-279氨基酸處各有一個SAHH活性功能區。但該文獻未提及黃瓜SAHH在微生物中的表達。
[0014]王倩等人(大腸桿菌密度感應缺陷株中SAHH基因克隆與表達的研究)在大腸桿菌密度感應缺陷株中表達了 GST-SAHH融合蛋白，產物大小為75kD。表達產物恢復了該缺陷菌株的甲基循環，表明產物具有SAHH活性。
[0015]王源(青島文昌魚SAHH基因的鑒定表達及進化分析，山東理工大學2008年碩士論文)在大腸桿菌中表達了青島文昌魚SAHH，編碼434氨基酸，分子量為48kD，產物具備酶活性。
[0016]寧波美康鄒炳德等人(基因工程菌，用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應用，專利申請號:20121002792.8)通過PCR技術從環境中篩選得到一個SAHH基因片段，該基因編碼416個氨基酸，和嗜酸熱硫化葉菌SAHH有98%同源性，但有13個氨基酸的差異。表達產物能催化腺苷同型半胱氨酸水解為腺苷和同型半胱氨酸，并且該SAHH對腺苷同型半胱氨酸的Km值為0.009+0.0009mM。
[0017]以上文獻和專利報道的SAHH在大腸桿菌系統中的表達，產物有生物學活性。但到目前為止，沒有SAHH在酵母中表達的報道。我們知道，相對于大腸桿菌系統，酵母系統有更完善的翻譯后修飾和加工功能。對許多真核蛋白來說，酵母表達產物往往較之原核表達產物有更高的活性，或更好的穩定性。

【發明內容】

[0018]本發明的目的是提供一種表達產物比活高，穩定性強的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法。 [0019]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:[0020]一種S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其包括以下步驟:
[0021](I)提供編碼S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的核苷酸序列；
[0022](2)將所述S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的核苷酸序列克隆到酵母表達載體中；
[0023](3)將所述酵母表達載體轉化至同一酵母宿主；
[0024](4)誘導所述酵母宿主表達N端帶有組氨酸標簽的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)；
[0025](5)純化所述N端帶有組氨酸標簽的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。
[0026]所述S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的核苷酸序列是指一切具有酶學編號為
3.3.1.1的、其編碼的蛋白具有能把S-腺苷同型半胱氨酸水解生成腺苷(Ado)和同型半胱氨酸(Hcy)的S腺苷同型半胱氨酸水解酶序列，它包含但不限于SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示的序列。本說明書中的實施例是已SEQ ID N0.1為例來說明的。
[0027]所述酵母表達載體為能夠用以表達外源蛋白的穿梭載體。
[0028]優選的是，所述酵母表達載體為pPIC9K、pPIC3.5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZa C、pPICZA、pPICZB、pPICZC*pA0815 中的任意一種。
[0029]優選的是，所述酵母宿主為漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母或光滑球擬酵母中的任
意一種。
[0030]優選的是，所述組氨酸標簽是含有六個或更多連續的組氨酸的氨基酸序列。
[0031]優選的是，所述步驟(4)中的誘導表達使用甲醇作為唯一碳源，并使甲醇的終濃度為0.5%~3% (體積比:V/V)0
[0032]優選的是，所述步驟(5)中的純化操作在Ni2+-NTA基質中進行，并采用咪唑或咪唑類似物溶液進行洗脫，洗脫采用的是20mmol/L至400mmol/L進行梯度洗脫目的蛋白。
[0033]本發明的有益效果為:
[0034]1.在酵母真核表達系統中進行重組表達，表達產物SAHH無需變性和復性，誘導表達后收集培養基上清即可得到有活性的SAHH。
[0035]2.表達工藝簡單，雜蛋白很少。即使不純化，蛋白純度可達80%以上。預計在發酵罐中，由于通氣量，甘油，甲醇含量更容易得到控制，表達量可以至少比搖瓶中提高數倍以上。
[0036]3.表達生成N端帶有組氨酸標簽(His tag)的SAHH，使得在后續的親和層析過程中，只需一步純化步驟即可得到純品。
[0037]4.如在誘導表達過程中使甲醇的終濃度達到0.5%至3%(V/V)，能夠更高效的表達SAHH。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的PCR產物，其中泳道M為DNA分子標準，泳道I為SAHH全基因PCR產物；
[0039]圖2為pPICZ a B-SAHH酶切鑒定示意圖；泳道M為DNA Marker,泳道I為pPICZ a B-SAHH酶切后產物；
[0040]圖3為酵母表達SAHH示意圖；泳道M為蛋白質分子量標準，泳道1、2分別為1.0%和2.0% (V/V)的甲醇誘導表達的酵母重組表達的SAHH ；
[0041]圖4為酵母表達SAHH純化后示意圖，泳道M為蛋白質分子量標準，泳道I為甲醇誘導前的陰性對照，泳道2為誘導4天后，培養液上清經過蛋白純化后的SAHH電泳檢測結
果O
【具體實施方式】
[0042]材料:
[0043]菌株和質粒:克隆菌種Escherichia coli (DH5a)是基因工程常用工具菌種；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS_115、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)KM_71、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) KM-71H、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) X-33、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) SMD-1168> 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) SMD-1168-H ;質粒 pPIC9K、pPIC3.5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pA0815 購于 invitrogen 公司。
[0044]酶和試劑:
[0045]實施例中涉及分子生物學操作所用的酶均購于北京經科宏達公司；
[0046]PCR純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒(全式金)、酵母DNA提取試劑盒均購于北京天根公司(TianGen)。
[0047]實施例中所涉及的編碼SAHH的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的測序工作由華大基因完成。
[0048]抗生素zeocin 購于 i nvitrogen 公司。
[0049]培養基:
[0050]LB培養基、zeocin抗性LB培養基、YPD培養基、zeocin抗性YPD培養基、YPDzeocin固體培養基、BMGY培養基、BMMY培養基
[0051]以上培養基是基因工程領域常用培養基，各培養基的配方可參見分子克隆第三版下冊附錄2以及invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(Mult1-Copy Pichia ExpressionKit)第 64 頁-第 70 頁；及 pPICZ α A, B, and C 第 17-第 18 頁。
[0052]方法:
[0053]聚合酶鏈反應，PCR產物純化，基因和質粒的酶切、回收、連接和轉化，以及大腸桿菌轉化子的篩選，鑒定，這些基因工程常規操作方法，可參見SambiOok J，FristshEF,Maniatis T.MolecularCloning;A Laboiatory Manual2nd ed.NY:Cold SpringHarbor Laboratory Piess, 1989，pp.16-340。重組酵母表達載體質粒的線性化，酵母轉化，轉化子的篩選、誘導表達以及表達鑒定，可參見invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(Mult1-Copy Pichia Expression Kit)第 32 頁-第 63 頁。及 pPICZ α A, B, and C 第 9_ 第14頁。
[0054]實施例1
[0055]本實施例S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其包括以下步驟:
[0056]1、重組pPICZ a B-SAHH表達載體的構建，其包括如下步驟:
[0057](I) SAHH全基因合成:化學合成SAHH基因的核苷酸，最終基因為SEQ ID NO:1所不的喊基序列。[0058](2)以上述合成的堿基序列作為模板，以設計的三條引物為上下游引物，進行巢式PCR擴增，其中首次PCR所需引物如下:
[0059]上游引物SY5F1 (下劃線為5’ His):
[0060]GAAGCTCATCACCACCATCACCATATGTCTGACAAGTTGCCATACAAG
[0061]下游引物SY5R(下劃線為NotI位點):
[0062]TTCTTGCGGCCGCTTATCAGTATCTGTAGTGGTCTGGCTTG
[0063]首次PCR反應體系為:
[0064]
【權利要求】
1.一種S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟: (1)提供編碼S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的核苷酸序列； (2)將所述S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的核苷酸序列克隆到酵母表達載體中； (3)將所述酵母表達載體轉化至同一酵母宿主； (4)誘導所述酵母宿主表達N端帶有組氨酸標簽的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH); (5)純化所述N端帶有組氨酸標簽的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。
2.根據權利要求1所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的核苷酸序列是指具有酶學編號為3.3.1.1的、其編碼的蛋白具有能把S-腺苷同型半胱氨酸水解生成腺苷(Ado)和同型半胱氨酸(Hcy)的S腺苷同型半胱氨酸水解酶序列。
3.根據權利要求2所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，所述S腺苷同型半胱氨酸水解酶具有SEQ ID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所述核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述酵母表達載體為能夠用以表達外源蛋白的穿梭載體。
5.根據權利要求3所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述酵母表達載體為 PPIC9K、pPIC3.5K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、pPICZC 或 pA0815 中的任意一種。
6.根據權利要求1所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述酵母宿主為漢遜酵母、畢赤酵母`、假絲酵母或光滑球擬酵母中的任意一種。
7.根據權利要求1所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述組氨酸標簽是含有至少六個連續的組氨酸的氨基酸序列。
8.根據權利要求1所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中的誘導表達使用甲醇作為唯一碳源，并使甲醇的終濃度為發酵液的0.5% ~3% (V/V)0
9.根據權利要求1所述的S腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中的純化操作在Ni2+-NTA基質中進行，并采用咪唑或咪唑類似物溶液進行梯度洗脫。
【文檔編號】C12R1/84GK103881990SQ201410040905
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月28日 優先權日:2013年4月11日
【發明者】彭毅, 龐朋沙, 翟文 申請人:北京愛必信生物技術有限公司