用于檢測人類egfr基因突變的引物及方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，特別是基因突變的檢測。更具體而言，本發明公開了檢測人類表皮生長因子EGFR基因41種突變的9組引物及使用其進行檢測的方法。
【專利說明】用于檢測人類EGFR基因突變的引物及方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明涉及基因突變的檢測，特別涉及檢測表皮生長因子EGFR基因突變的引物及其方法。

【背景技術】
[0003]表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是上皮生長因子(EGF)細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR屬于HER或ErbB受體家族的一員，該家族包括EGFR (ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4) ? EGFR 也常被稱作HERl或ErbBl。EGFR及其家族成員能夠調控細胞分化、凋亡、細胞運動、新血管生成、浸潤和轉移等多項生理過程，同時在大部分的人類腫瘤中都有表達，因此EGFR已經被證明在眾多腫瘤的發生、發展及預后過程中發揮了重要調控作用。
[0004]EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase, TK)活性的受體，TK在EGFR的活性中發揮了關鍵作用。美國FDA批準對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的患者，進行EGFR基因突變檢測。需要指出，檢測EGFR基因突變并不能作為患者是否患癌的依據。在我國《NCCN:非小細胞肺癌臨床實踐指南(中國版)》中只是明確提出了臨床實踐中EGFR-TKI治療前需要針對EGFR編碼區第18、19、20和21外顯子的突變位點開展檢測。確定患者是否攜帶有EGFR突變在一定程度上避免無效用藥和社會經濟資源的浪費。近年來，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(Epidermal Growth Factor Receptor-TyrosineKinase Inhibitor, EGFR-TKI)類藥物(包括吉非替尼和厄洛替尼等)已經在非小細胞肺癌等腫瘤的特定患者的臨床治療中被證明效果顯著(Paez JG, et al.Science.2004;304:1497-1500)。EGFR-TKI能夠有效延長患者的生存期，但研究表明患者個體EGFR的第18、19、20和21號外顯子的突變狀態(尤其是19號外顯子的插入缺失以及21號外顯子L858R點突變最為常見)和療效密切相關，占到突變總數的90%以上(Chan SK et al.EurJ Cancer 42，1，2006, 17-23)。因此，在引物設計時包含核心突變區的高頻突變點和盡可能多的突變點，檢測時將會最大程度上降低EGFR突變檢測的假陰性。
[0005]目前，使用最多的臨床基因突變檢測方法是PCR測序法，PCR測序法是目前默認的“金標準”。其它常用的方法還包括PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、Real time PCR法、DHPLC和ARMS法等。PCR測序法敏感度較低，對低質量或含量較低的樣本檢測會產生較大的假陽性和假陰性。ARMS法能將突變檢測的選擇性提高到1%，但是對于質量低或含量低的DNA樣品，這樣的選擇性依然偏低。另外，ARMS法依靠常規凝膠電泳或探針雜交來檢測PCR產物，對于因樣品含量較低導致擴增效率較低的突變產物，在電泳條帶上可能不能顯示。同時，該方法不能對樣品所含突變進行定量或半定量分析。本領域需要可高靈敏度和高選擇性地進行突變檢測的PCR技術。


【發明內容】

[0006]為了解決現有技術中存在的問題，本發明使用了一種加熒光并結合毛細管電泳的阻滯PCR技術方法(AMP-MDS)。
[0007]具體而言，本發明提供了一種檢測人類表皮生長因子EGFR基因41種突變的基于人工修飾的引物及PCR方法。其中，所述PCR方法包括如下步驟:
1)對于EGFR基因的41種突變(位于18、19、20和21號的外顯子)，對每一個點突變設計包括一對外引物和兩個內引物的組合；對每一個缺失突變或者插入突變，設計一對外引物，其中所述兩個內引物方向相向，3’端位于突變位置處，一個內引物的3’端和正常堿基互補，另一個內引物的3’端與突變位置的突變堿基互補；所述兩個外引物分別和一個內引物可以配對進行PCR擴增，它們自身也可以進行配對擴增；所述兩個外引物配對擴增的產物以及所述兩個外引物分別和所述兩個內引物所配對產生的兩個產物的長度差均須在5 bp以上；在所述內引物3’端倒數5個堿基的區域引入錯配，按照熱力學穩定性高低相間的模式引入(低熱力學穩定性是指引物與模板結合能力弱，不穩固，例如含有兩個氫鍵的AT配對，或者AC，AG等錯配；高熱力學穩定性是指引物與模板結合能力強，比較穩固，如含有三個氫鍵的CG配對)；將熒光加在外引物的5’端，且使用不同顏色的熒光染料對兩個內引物進行標記；
2)用步驟I)中的各組引物分別擴增來自待測樣品的模板序列，對于點突變，得到所述兩個外引物配對擴增的產物I以及所述兩個外引物分別和所述兩個內引物所配對產生的產物2和產物3 ;對于插入突變或者缺失突變，得到長度有差異的兩條產物；
3)將上述產物通過熒光毛細管電泳進行分析，對于點突變，在產物1、產物2和產物3均有峰值時，表示在突變位置有突變堿基；對于插入突變或缺失突變，如果有兩個峰值時，表示有插入突變或缺失突變。
[0008]在一個實施方案中,所述PCR方法還包括定量步驟:
4)進一步計算每一個峰值與標準品的峰值的比值，得到突變堿基的含量和正常堿基的含量的定量比值。
[0009]共41種突變
在本發明中，肺癌患者表皮生長因子(EGFR)基因的41種突變具體詳見表1。
[0010]表1肺癌患者表皮生長因子(EGFR)基因的41種突變

【權利要求】
1.用于檢測人類EGFR基因突變的引物，包括下列9組引物:
(1)G719S_0UT_FP: SEQ ID N0.1、
G719S_0UT_RP: SEQ ID N0.2、
G719S_IN_FP: SEQ ID N0.3、
G719S_IN_RP: SEQ ID N0.4 ；
(2)G719C_0UT_FP: SEQ ID N0.1、
G719C_0UT_RP: SEQ ID N0.2、
G719C_IN_FP: SEQ ID N0.5、
G719C_IN_RP: SEQ ID N0.6 ；
(3)G719A_0UT_FP: SEQ ID N0.7,
G719A_0UT_RP: SEQ ID N0.8、
G719A_IN_FP: SEQ ID N0.9、
G719A_IN_RP: SEQ ID N0.10 ；
(4)Exl9-del_OUT_FP: SEQ ID N0.11、
Exl9-del_OUT_RP: SEQ ID N0.12 ；
(5)S768I_OUT_FP: SEQ ID N0.13、
S768I_OUT_RP: SEQ ID N0.14、
S768I_IN_FP: SEQ ID N0.15、
S768I_IN_RP: SEQ ID N0.16 ；
(6)T790M_0UT_FP: SEQ ID N0.17、
T790M_0UT_RP: SEQ ID N0.18、
T790M_IN_FP: SEQ ID N0.19、
T790M_IN_RP: SEQ ID N0.20 ；
(7)Ex20-1ns_0UT_FP: SEQ ID N0.21、
Ex20-1ns_0UT_RP: SEQ ID N0.22 ；
(8)L858R_OUT_FP: SEQ ID N0.23、
L858R_OUT_RP: SEQ ID N0.24、
L858R_IN_FP: SEQ ID N0.25、
L858R_IN_RP: SEQ ID N0.26 ；
(9)L861Q_OUT_FP: SEQ ID N0.27、
L861Q_OUT_RP: SEQ ID N0.28、
L861Q_IN_FP: SEQ ID N0.29、
L861Q_IN_RP: SEQ ID N0.30。
2.一種檢測人類EGFR基因突變的方法，包括以下步驟: 用權利要求1所述的9組引物擴增來自待測樣品的模板； 使用通過熒光毛細管電泳進行分析，對于點突變，如果出現三個峰值時，表示在突變位置有突變堿基；對于插入突變或缺失突變，如果有兩個峰值時，表示有插入突變或缺失突變。
3.權利要求2的方法，還包括步驟:進一步計算每一個峰值與標準品的峰值的比值，得到突變堿基的含量和正常堿基的含量的定量比值。
4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于:步驟2)所述的待測樣品包括手術切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病理組織、石蠟切片、全血、血漿、血清或胸腔積液。
5.如權利要求2-4任一項所述的方法，其中擴增用包括如下的PCR反應體系進行: PCR緩沖液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
6.如權利要求5所述的方法，其中用于擴增的PCR反應體系包括: PCR緩沖液
rTaq 酶 2.5 μ L
1X緩沖液5 μ L
dNTP-MIX 200 μ mol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物各I μ L
甲酰胺I yL。
7.一種試劑盒，包括:權利要求1所述的9組引物。
8.如權利要求7所述的試劑盒，還包括PCR反應緩沖液。
9.如權利要求8所述的試劑盒，還包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
【文檔編號】C12N15/11GK104131091SQ201410346892
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月21日 優先權日:2014年7月21日
【發明者】不公告發明人 申請人:思博奧科生物信息科技（北京）有限公司