一種賴氨酸的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種賴氨酸的生產方法，該方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其特征在于，在發酵培養2-6小時后至發酵培養12-16小時內向發酵液中流加促進劑，在發酵培養12-16小時后至發酵培養結束前6-8小時內向發酵液中流加無機鹽，在發酵培養16-20小時后至發酵培養40-42小時內向發酵液中流加氨基酸，在發酵培養20-24小時后至發酵培養42-48小時內向發酵液中流加維生素，其中，該促進劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中的一種或多種。本發明提供的方法能夠提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉化率。
【專利說明】一種賴氨酸的生產方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種賴氨酸的生產方法。

【背景技術】
[0002] 賴氨酸是人和動物營養的八種必需氨基酸之一，它對調節體內代謝平衡、提高體 內對谷類蛋白質的吸收、改善人類膳食營養和動物營養、醋精生長發育均有重要作用。目前 主要用于醫藥、食品和飼料工業，從消費結構上看，賴氨酸在飼料中的消費占了近90%，而 在食品及醫藥中間體的消費僅占10%。
[0003] -般情況下賴氨酸的生產是通過將賴氨酸發酵菌種經過種子培養后接種至發酵 培養基中發酵產生賴氨酸。在賴氨酸發酵過程中，需要碳水化合物、蛋白質和前體等物質提 供能量和構成特定產物的需要，其營養物質一般包括碳源、氮源（有機氮源、無機氮源）、無 機鹽及微量元素、生長因子、前體、產物促進和抑制劑等。
[0004] 在賴氨酸的發酵過程中，隨著發酵的進行，賴氨酸酸度逐漸提高，且隨著碳源和氮 源的流加以及發酵過程中的放料，發酵罐中碳、氮以外的其他營養物質的濃度逐漸降低，賴 氨酸菌種過早衰老、自溶，代謝能力下降，發酵產酸速率呈下降趨勢；最終因發酵產酸速率 緩慢而放罐，致使限制了賴氨酸的產能，成本較高，經濟效益較低；另外，培養基中的各底物 避免不了相互之間的抑制，降低有效成分，同時也降低了發酵水平，不利于賴氨酸的產能。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是克服現有技術中賴氨酸產能不高的缺陷的提供一種新的賴氨酸 的生產方法。
[0006] 本發明人在研究中意外發現，根據賴氨酸不同的生長周期的營養需求，對賴氨酸 的發酵過程進行調控，優化出合理的培養基成分的添加順序和添加周期：即在發酵培養 2-6小時后至發酵培養12-16小時內向發酵液中流加促進劑，在發酵培養12-16小時后至 發酵培養結束前6-8小時內向發酵液中流加無機鹽，在發酵培養16-20小時后至發酵培養 40-42小時內向發酵液中流加氨基酸，在發酵培養20-24小時后至發酵培養42-48小時內 向發酵液中流加維生素，能夠提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉化率，即提高賴氨酸產 能，從而提高經濟效益。這可能是因為根據賴氨酸發酵不同周期產賴氨酸變化，流加賴氨 酸發酵所需的營養物質可以減少培養基底物之間的相互抑制和減少底物之間的美拉德反 應，進而提高培養基中有效成分的利用率；此外，促進劑可以促進葡萄糖氧化酶的形成，保 證TCA循環酶系活力，改進了細胞膜的滲透性，同時增強了氧的傳遞速度，改善了菌體對氧 的有效利用，以增加賴氨酸的積累。
[0007] 為了實現上述目的，本發明提供一種賴氨酸的生產方法，該方法包括將賴氨酸發 酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其中， 在發酵培養2-6小時后至發酵培養12-16小時內向發酵液中流加促進劑，在發酵培養12-16 小時后至發酵培養結束前6-8小時內向發酵液中流加無機鹽，在發酵培養16-20小時后至 發酵培養40-42小時內向發酵液中流加氨基酸，在發酵培養20-24小時后至發酵培養42-48 小時內向發酵液中流加維生素，其中，所述促進劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨 基三乙酸鈉中的一種或多種。
[0008] 本發明提供的賴氨酸的生產方法，可提高終點賴氨酸含量、單罐供酸量和轉化率， 即提1?賴氣酸廣能，從而提1?經濟效益。
[0009] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【具體實施方式】
[0010] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0011] 本發明提供了一種賴氨酸的生產方法，該方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸 發酵培養基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其中，在發酵培養2-6小 時后至發酵培養12-16小時內向發酵液中流加促進劑，在發酵培養12-16小時后至發酵培 養結束前6-8小時內向發酵液中流加無機鹽，在發酵培養16-20小時后至發酵培養40-42 小時內向發酵液中流加氨基酸，在發酵培養20-24小時后至發酵培養42-48小時內向發酵 液中流加維生素，其中，所述促進劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中 的一種或多種。
[0012] 需要說明的是，"在發酵培養2-6小時后"指的是在發酵培養2-6小時的時間段內 選擇流加促進劑的時間起點，"至發酵培養12-16小時內"指的是在發酵培養12-16小時內 選擇流加促進劑的時間終點，在選擇的流加促進劑的時間起點至選擇的流加促進劑的時間 終點的這個時間段內可以采用間歇流加或連續流加方式，向發酵液流加無機鹽、氨基酸和 維生素的時間段的選擇與此類似。
[0013] 為了更好的提高賴氨酸產能，優選地，在發酵培養2-6小時后至發酵培養12-15小 時內向發酵液中流加促進劑，在發酵培養13-15小時后至發酵培養結束前6-8小時內向發 酵液中流加無機鹽，在發酵培養16-18小時后至發酵培養40-42小時內向發酵液中流加氨 基酸，在發酵培養20-22小時后至發酵培養45-48小時內向發酵液中流加維生素。
[0014] 本發明中，發酵培養基為本領域技術人員公知的概念，指微生物發酵所需的供微 生物生長和維持用的人工配制的養料。
[0015] 本發明中，促進劑是指那些細胞生長非必需的且既不是營養物質又不是前體，但 卻能提1?廣量的添加劑。
[0016] 根據本發明，所述促進劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中 的一種或多種。考慮到有機金屬離子螯合劑的螯合能力和螯合物的穩定性受發酵培養所需 的pH值的影響，優選情況下，所述促進劑為乙二胺四乙酸。
[0017] 根據本發明，所述賴氨酸發酵培養基可以為含有促進劑的培養基或不含促進劑的 培養基。考慮到利于賴氨酸的生長，優選情況下，所述賴氨酸發酵培養基為含有促進劑的培 養基。
[0018] 本發明對賴氨酸發酵培養基的其他成分（碳源、氮源、無機鹽、氨基酸和維生素） 無特殊要求，可以采用本領域常規使用的物質，例如，可以用淀粉質原料液化清液、糖蜜、玉 米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、生物素、煙 酰胺和維生素 B1等配制本發明的培養基。
[0019] 根據本發明，每升賴氨酸發酵培養基中各原料的用量可以在很大范圍內改變，優 選情況下，相對于每升賴氨酸發酵培養基，淀粉質原料液化清液的用量可以為30-70克， 糖蜜的用量可以為20-40克，玉米漿（干重為18-52重量％ )的用量可以為25-50克，硫 酸銨的用量可以為30-50克，磷酸二氫鉀的用量可以為0. 4-1. 2克，硫酸鎂的用量可以為 0. 2-0. 5克，硫酸亞鐵的用量可以為0. 01-0. 05克，硫酸錳的用量可以為0. 01-0. 08克， 蘇氨酸的用量可以為〇. 1-0. 4克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 5克，谷氨酸的用量可以為 0. 2-0. 6克，生物素的用量可以為0. 05-0. 8毫克，煙酰胺的用量可以為0. 1-1. 0毫克，維生 素 B1的用量可以為0. 2-0. 8毫克，促進劑的用量可以為9-25克。
[0020] 其中，所述淀粉質原料液化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法 制糖工藝制備。從工藝簡單、設備投資少，生產成本較低的方面考慮，優選通過干法制糖工 藝制備。
[0021] 干法制糖工藝是指淀粉質原料不經浸泡直接進行破碎和酶解。干法制糖工藝可以 包括：將淀粉質原料粉碎，將淀粉質原料粉碎后的產物調漿，并加入淀粉酶對淀粉進行第一 次水解（酶解），然后進行碘試，碘試呈本色合格，不需進行二次酶解，若碘試不合格，需進 行二次水解（酶解）：在第一水解產物中加入淀粉酶進行第二次水解，碘試合格，對二次水 解產物進行固液分離得到淀粉質原料液化清液。
[0022] 優選地，粉碎使淀粉質原料過60目篩的通過率大于66%，更優選過60目篩的通過 率為100%。其中，所述調漿的方法為本領域技術人員所熟知，優選地，調漿的方法可以包括 將淀粉質原料粉碎后的產物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以 為14-17波美度（波美度是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計檢測溶液得到的 度數）。
[0023] 所述淀粉質原料可以為本領域公知的各種可以用于酶解、發酵制備賴氨酸的含有 淀粉的原料，例如，可以為選自玉米、薯類（如木薯）和小麥中的一種或幾種。
[0024] 根據本發明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產物的干重計，淀粉酶的用量可以 為110-130個酶活力單位，酶解的溫度可以為82-84°C，酶解的時間可以為90-120分鐘，酶 解的pH值可以為5. 8-6.0。
[0025] 根據本發明，在第二次水解中，以每克液相組分計，淀粉酶的用量可以為10-30個 酶活力單位，酶解的溫度可以為90-95°C，酶解的時間可以為10-20分鐘，酶解的pH值可以 為5. 8-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優選地，固液分離的條件使得到的液相組分 中的固含量為19-22重量％，更優選為20-21重量％。
[0026] 本發明酶活力單位的定義為：在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫 克淀粉轉化為還原性糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0027] 淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉 酶、β-淀粉酶。
[0028] α -淀粉酶又稱淀粉1，4-糊精酶，它能夠任意地、不規則地切開淀粉鏈內部的 α -1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生 產此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
[0029] β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4-糖 苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和 內孢霉產生。
[0030] 根據本發明，優選使用α -淀粉酶。
[0031] 本發明中，優選地，所述淀粉質原料液化清液中的葡萄糖含量為20-30重量％。
[0032] 在本發明中，發酵液為本領域技術人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培 養基經過一段時間的培養后所得產物。
[0033] 根據本發明，流加的碳源、氮源、無機鹽、氨基酸和維生素為本領域的公知的各種 碳源、氮源、無機鹽、氨基酸和維生素。優選情況下，所述碳源為淀粉質原料液化清液；所述 氮源為銨鹽，所述銨鹽為硫酸銨；所述無機鹽為硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳和磷酸二氫鉀中 的一種或多種；所述氨基酸為蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸中的一種或多種；所述維生素為生 物素、煙酰胺和維生素 Β1中的一種或多種。
[0034] 根據本發明，流加促進劑的量使發酵液中促進劑的濃度控制在8-12克/升；流 加無機鹽的量使發酵液中無機鹽的濃度控制在〇. 01-1. 2克/升，流加氨基酸的量使發酵 液中氨基酸的濃度控制在〇. 1-0. 6克/升，流加維生素的量使發酵液中維生素的濃度控制 在0. 05-1毫克/升。優選情況下，為了進一步提高賴氨酸的產能，流加促進劑的量使發酵 液中促進劑的濃度控制在9-11克/升；流加硫酸鎂的量使發酵液中硫酸鎂的濃度控制在 0. 2-0. 5克/升，流加硫酸亞鐵的量使發酵液中硫酸亞鐵的濃度控制在0. 01-0. 05克/升， 流加硫酸錳的量使發酵液中硫酸錳的濃度控制在〇. 01-0. 08克/升，流加磷酸二氫鉀的量 使發酵液中磷酸二氫鉀的濃度控制在〇. 4-1. 2克/升；流加蘇氨酸的量使發酵液中蘇氨酸 的濃度控制在〇. 1-0. 4克/升，流加蛋氨酸的量使發酵液中蛋氨酸的濃度控制在0. 1-0. 5 克/升；流加谷氨酸的量使發酵液中谷氨酸的濃度控制在〇. 2-0. 6克/升；流加生物素的 量使發酵液中生物素的濃度控制在〇. 05-0. 8毫克/升，流加煙酰胺的量使發酵液中煙酰 胺的濃度控制在〇. 1-1毫克/升，流加維生素 Β1的量使發酵液中維生素 Β1的濃度控制在 0. 2-0. 8毫克/升。對于流加各物質的濃度和流速無特殊要求，只要使發酵液中各物質的濃 度控制在上述范圍內即可。
[0035] 本發明提供的賴氨酸的生產方法相對于現有技術的改進主要在于根據賴氨酸生 長周期，對賴氨酸的發酵過程進行調控，優化出合理的培養基成分的添加順序和添加周期。 因此，對于賴氨酸發酵的其他條件和操作沒有特殊要求，可以采用本領域常用的條件和操 作。
[0036] 本發明中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培養基為基準，賴氨酸發 酵菌種的接種量優選為10-18體積％。本領域技術人員應該理解的是，賴氨酸發酵菌種在 被接種至發酵培養基中之前，采用常規方法將賴氨酸發酵菌種經過種子罐培養，然后再將 菌種接入發酵培養基中。在種子罐培養的培養程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、〇D (optical density)值測定對賴氨酸發酵菌種的生長進行觀察，當通過上述方法觀察菌體形態正常、 測定0D值達到0. 8以上時停止培養，將此時種子罐中的種子液稱為成熟種子液，然后再將 成熟種子液接入發酵培養基中。因此，本發明中，賴氨酸發酵菌種的接種量優選為10-18體 積％，指的是接入發酵培養基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發酵培養基體積 的 10-18%。
[0037] 本領域中一般均采用0D值來表示種子液中賴氨酸發酵菌種的數量，本發明也沿 用本領域的采用0D值來表示種子液中賴氨酸發酵菌種的數量的習慣。且本發明中，0D值 用722N可見光分光光度計測定。
[0038] 根據本發明，種子罐培養可以采用一級種子罐培養也可以采用二級種子罐培養， 一級種子罐培養即將賴氨酸發酵菌種在一個種子罐中一直培養到所需的培養程度；二級種 子罐培養即先將賴氨酸發酵菌種在一個種子罐中培養一段時間后再轉入另一個種子罐繼 續培養，培養到所需的培養程度。二級種子罐培養在各個種子罐的培養時間沒有具體限定， 只要最終能培養到所需的培養程度即可。為了操作方便，本發明的種子罐培養優選采用一 級種子罐培養。
[0039] 本發明中，對于種子罐培養基的成分無特殊要求，可以采用本領域常用的種子罐 培養基，例如，可以用淀粉質原料液化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸、 蛋氨酸、谷氨酸、生物素、煙酰胺和維生素 B1等配制種子罐培養基。根據本發明，每升種子 罐培養基中各原料的用量可以在很大范圍內改變，優選情況下，每升種子罐培養基中，淀粉 質原料液化清液的用量可以為25-45克，玉米楽（干重為18-52重量％ )的用量可以為 65-80克，磷酸二氫鉀的用量可以為0. 3-1. 8克，硫酸鎂的用量可以為0. 2-1. 5克，硫酸銨的 用量可以為6-12克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 8克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 5克，谷 氨酸的用量可以為〇. 2-0. 8克，生物素的用量可以為0. 01-0. 1毫克，煙酰胺的用量可以為 0. 1-5暈克，維生素 B1的用量可以為0. 2-1. 0暈克。
[0040] 本發明中，優選情況下，流加碳源的量使發酵液中還原性糖的濃度控制在4-10克 /升，流加氮源的量使發酵液中氮的濃度控制在〇. 8-1克/升。此處"流加碳源的量使發酵 液中還原性糖的濃度控制在4-10克/升，流加氮源的量使發酵液中氮的濃度控制在0. 8-1 克/升"是指通過控制流加碳源和流加氮源的速度來使在整個發酵培養過程中發酵液中還 原性糖的濃度維持在4-10克/升，使發酵液中氮的濃度維持在0. 8-1克/升。
[0041] 本發明中，當氮源為銨鹽時，培養基中氮的濃度以銨根離子的濃度表示，氮的濃度 控制在0. 8-1克/升，則銨根離子的濃度控制在1. 0-1. 3克/升。
[0042] 本發明的發明人在實驗中發現，對于碳源和氮源的流加，以及各種培養基成分的 流加，連續流加比間歇流加的發酵效果好，因此，本發明中的流加優選為連續流加。
[0043] 本發明中，發酵培養的設備為本領域技術人員所公知，例如，可以使用發酵罐進行 發酵培養。本領域技術人員應該理解的是，賴氨酸的發酵培養應該在空氣中進行。為了有 效利用發酵罐的產能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發酵罐中的培養基的體積優選為 發酵罐體積的30-60%，隨著流加碳源和流加氮源以及流加各種培養基成分，發酵罐中的培 養基的體積逐漸增大，為了保證發酵罐中的空氣量，優選為當流加碳源和流加氮源以及流 加所述促進劑、無機鹽、氨基酸和維生素至發酵罐體積的70-80%時放料，為了保證放料后 發酵罐中的菌種數量，不影響放料后發酵罐中的發酵培養，放料體積優選為放料前發酵罐 中培養基體積的5-10%。
[0044] 現有技術中，將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中，在流加碳源和流加氮 源的條件下，進行發酵培養，隨著發酵的進行，賴氨酸酸度逐漸提高，營養物質逐漸降低，發 酵產酸速率呈下降趨勢，當營養物質降低到一定程度后，發酵產酸速率降低到一定程度即 判斷為發酵終點，達到發酵終點即放罐，放罐是指將發酵罐中的培養基全部從發酵罐中放 出，即停止發酵。現有技術中一般發酵培養40-50小時后放罐。本發明由于在發酵培養過程 中流加各種營養物質，因此可適當延長發酵培養的時間，優選發酵培養42-54小時后放罐。 [0045] 本領域技術人員應該理解的是，為了得到純度較高的賴氨酸產品，本發明方法還 包括從放料或放罐的溶液中提取賴氨酸。對于提取賴氨酸的方法無特殊要求，可以采用本 領域常用的各種方法，例如，采用連續離子交換分離提取方法，向放料或放罐的溶液中加入 大量的濃硫酸調pH至2. 0-3. 0進行酸化，酸化后經過金屬膜或陶瓷膜過濾除去菌體，得到 賴氨酸膜濾液即賴氨酸清液，或將酸化后的賴氨酸發酵液經絮凝過濾除菌體后得到賴氨酸 清液，除菌體后的賴氨酸清液采用強酸型陽離子交換樹脂進行吸附交換，樹脂吸附飽和后 用稀氨水進行洗脫，洗脫下來的賴氨酸經濃縮、鹽酸調節pH值、結晶、固液分離、烘干，得到 賴氨酸鹽酸鹽成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使賴氨酸發酵液酸化，經過濾或離 心等方法除去菌體。在除去菌體后的賴氨酸清液中加入氫氧化鈣調節pH值至8. 0-11. 5,使 賴氨酸清液中的鹽、膠體等雜質生成不溶物，經固液分離后得到賴氨酸溶液，將賴氨酸溶液 濃縮至每毫升賴氨酸溶液中賴氨酸的含量為0. 6-0. 8g，再經過過濾可以得到高純度的賴氨 酸溶液，然后經濃縮、鹽酸調節pH值、結晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品。
[0046] 本發明中，對發酵培養的條件無特殊要求，可以采用本領域常用的條件，優選情況 下，所述發酵培養的條件包括：溫度為35-38°C，壓力為0. 05-0. IMPa，pH值為6. 7-7. 4,通氣 量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養基/分鐘。
[0047] 本發明中，對賴氨酸發酵菌種的種類無特殊要求，可以采用本領域常用的菌種，優 選為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
[0048]另外，本領域技術人員應該理解的是，接入種子罐進行培養的菌種為經過活化后 進行增殖培養后的菌種。活化和增殖培養為本領域的公知常識，在此不再贅述。
[0049] 以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。
[0050] 在下述實施例和對比例中：甜菜糖蜜購于山東聊城盈動商貿有限公司。
[0051] 0D值測定：將取樣的發酵液進行26倍稀釋，采用722N可見光分光光度計，在波長 562納米可見光下測定吸光值，即為0D值。
[0052] 按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發酵液中還原性糖的濃度。
[0053] 按照GB3595-83的方法測定發酵液中銨根離子的濃度。
[0054] 按照GB/T 1274-2011的方法測定發酵液中磷酸二氫鉀的濃度。
[0055] 按照GB/T 664-93的方法測定發酵液中硫酸亞鐵的濃度。
[0056] 按照GB/T671-1998的方法測定發酵液中硫酸鎂的濃度。
[0057] 按照GB/T15899-1995的方法測定發酵液中硫酸錳的濃度。
[0058] 按照GB/T 21979-2008的方法測定發酵液中蘇氨酸的濃度。
[0059] 按照GB/T 17810-2009的方法測定發酵液中蛋氨酸的濃度。
[0060] 按照生物傳感儀法測定發酵液中谷氨酸的濃度。
[0061] 按照GB/T 23180-2008的方法測定發酵液中生物素的濃度。
[0062] 按照GB/T 7301-2002的方法測定發酵液中煙酰胺的濃度。
[0063] 按照GB/T 14700-2002的方法測定發酵液中維生素 B1的濃度。
[0064] 按照GB10794-89標準檢測發酵液中的賴氨酸濃度（以賴氨酸鹽酸鹽計）。
[0065] 單罐供酸量=(放罐的賴氨酸濃度X放罐體積+中間放料賴氨酸濃度X中間放 料體積）。
[0066] 轉化率（％ )=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用 糖重量和發酵罐用糖重量。
[0067] 在下述實施例和對比例中：淀粉質原料液化清液按照以下方法制備：
[0068] (1)將收獲的100重量份玉米通過機械加工將玉米顆粒粉碎，使玉米粉過60目篩 的通過率為80%。
[0069] (2)將粉碎后的產物加水調漿至14Β?°，相對于每克粉碎產物的干重，加入120個 酶活力單位的淀粉酶（諾維信公司，α -淀粉酶），在84°C、pH為5. 8的條件下酶解100分 鐘，然后進行碘試，碘試呈本色合格，不需進行二次酶解，若碘試不合格，需加入20個酶活 力單位的淀粉酶，在90°C、pH為6. 0的條件下繼續酶解20分鐘，然后進行二次碘試，碘試合 格，得到酶解產物，然后將酶解產物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解清液即 淀粉質原料液化清液（固含量為20重量％ )，淀粉質原料液化清液中的葡萄糖含量約為25 重量％。
[0070] 實施例1
[0071] 本實施例用于說明本發明提供的賴氨酸的生產方法。
[0072] (1)配制種子罐培養基，具體組成為：相對于每升培養基，取淀粉質原料液化清液 的用量為35克，玉米楽（干重為35重量％ )的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為1. 0克， 硫酸鎂的用量為〇. 5克，硫酸銨的用量為10克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為 〇. 2克，谷氨酸的用量0. 2克，生物素的用量為0. 01暈克，煙酰胺的用量為0. 1暈克，維生 素 B1的用量為0.2毫克。將培養基加熱到121°C消毒，維持20分鐘后降溫至37°C并保持 恒定。開啟攪拌，調節罐壓為〇. IMPa，按照通風量與培養基1:0. 5體積比通入無菌空氣，用 氨水調節pH至6. 8并保持恒定。將黃色短桿菌菌種（菌株原種FB42購自江南大學）活化 和增殖后接入種子罐中進行培養，培養過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測定0D值，當鏡檢 菌體形態正常且0D值達到0. 8時停止培養，得到成熟種子液。
[0073] (2)配制發酵培養基，具體組成為：相對于每升發酵培養基，取淀粉質原料液化清 液的用量為50克，甜菜糖蜜的用量為40克，玉米楽（干重為35重量％ )的用量為30克， 硫酸銨的用量為30克，磷酸二氫鉀的用量為1. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸錳的用量 為0. 01克，硫酸亞鐵的用量為0. 01克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷 氨酸的用量為〇. 3克，生物素的用量為0. 05暈克，煙酰胺的用量為0. 1暈克，維生素 B1的 用量為0.2毫克，乙二胺四乙酸（EDTA)的用量為9克。將培養基加熱到121°C消毒30分鐘 后降溫至37 °C并保持恒定，用氨水調節pH至6. 9。
[0074] (3)在發酵罐中裝入步驟（2)中配制好的發酵培養基，發酵培養基的體積為發酵 罐體積的30%。將步驟（1)所得的成熟種子液，接入發酵罐的培養基中進行發酵培養，以 接種后的發酵培養基為基準，步驟（2)所得的成熟種子液的接種量為15體積％。接種后連 續流加淀粉質原料液化清液和硫酸銨，流加淀粉原料液化清液的量使發酵液中還原性糖的 濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使發酵液中銨根離子的濃度控制在1. 0-1. 3克/ 升。將罐壓控制為0. IMPa，發酵溫度控制為37°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培 養基/分鐘，并用液氨調節pH維持在7. 0進行發酵培養。分別在發酵培養2小時后至發酵 培養12小時內向發酵液中連續流加 EDTA，流加 EDTA的量使發酵液中EDTA的濃度控制在9 克/升；在發酵13小時后至發酵培養結束前6小時向發酵液中連續流加磷酸二氫鉀、硫酸 鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳，流加磷酸二氫鉀的量使發酵液中磷酸二氫鉀的濃度控制在0. 4克/ 升，流加硫酸鎂的量使發酵液中硫酸鎂的濃度控制在〇. 2克/升，流加硫酸亞鐵的量使發酵 液中硫酸亞鐵的濃度控制在〇. 01克/升，流加硫酸猛的量使發酵液中硫酸猛的濃度控制在 0. 01克/升；在發酵培養16小時至發酵培養42小時內向發酵液中連續流加蘇氨酸、蛋氨 酸和谷氨酸，流加蘇氨酸的量使發酵液中蘇氨酸的濃度控制在〇. 1克/升，流加蛋氨酸的量 使發酵液中蛋氨酸的濃度控制在〇. 1克/升，流加谷氨酸的量使發酵液中谷氨酸的濃度控 制在〇. 2克/升；在發酵培養20小時后至發酵培養45小時內向發酵液中連續流加生物素、 煙酰胺和維生素 B1，流加生物素的量使發酵液中生物素的濃度控制在0. 05毫克/升，流加 煙酰胺的量使發酵液中煙酰胺的濃度控制在〇. 1毫克/升，流加維生素 B1的量使發酵液中 維生素 B1的濃度控制在0. 2毫克/升。
[0075] 流加淀粉質原料液化清液和硫酸銨，以及流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、煙酰胺和維生素 B1至發酵罐體積的75%時放料，放料 體積為放料前發酵罐中培養基體積的8%。發酵培養42小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃 度（即終點賴氨酸含量，下同）和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。
[0076] 實施例2
[0077] 本實施例用于說明本發明提供的賴氨酸的生產方法。
[0078] 種子罐培養基配方、種子罐成熟種子液培養方法、發酵罐培養基配方均與實施例1 相同。
[0079] 發酵罐中的培養基體積為發酵罐體積的40 %。將成熟種子液接入發酵罐的培養基 中進行發酵培養，以接種后的發酵培養基為基準，種子液的接種量為12體積％。接種后連 續流加制得的淀粉質原料液化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質原料液化清液的量使發酵 液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使發酵液中銨根離子的濃度控制 在1. 0-1. 3克/升，將罐壓控制為0. 08MPa，發酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 8立方米空 氣/立方米的培養基/分鐘，并用液氨調節pH維持在7. 2進行發酵培養。分別在發酵培養 6小時后至發酵培養15小時內向發酵液中連續流加 EDTA，流加 EDTA的量使發酵液中EDTA 的濃度控制在11克/升；在發酵15小時后至發酵培養結束前7小時向發酵液中連續流加 磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳，流加磷酸二氫鉀的量使發酵液中磷酸二氫鉀的濃 度控制在1. 2克/升，流加硫酸鎂的量使發酵液中硫酸鎂的濃度控制在0. 5克/升，流加硫 酸亞鐵的量使發酵液中硫酸亞鐵的濃度控制在0. 05克/升，流加硫酸錳的量使發酵液中硫 酸錳的濃度控制在〇. 08克/升；在發酵培養17小時至發酵培養40小時內向發酵液中連 續流加蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加蘇氨酸的量使發酵液中蘇氨酸的濃度控制在〇. 4克/ 升，流加蛋氨酸的量使發酵液中蛋氨酸的濃度控制在0. 5克/升，流加谷氨酸的量使發酵液 中谷氨酸的濃度控制在〇. 6克/升；在發酵培養21小時后至發酵培養46小時內向發酵液 中連續流加生物素、煙酰胺和維生素 B1，流加生物素的量使發酵液中生物素的濃度控制在 〇. 8毫克/升，流加煙酰胺的量使發酵液中煙酰胺的濃度控制在1. 0毫克/升，流加維生素 B1的量使發酵液中維生素 B1的濃度控制在0. 8毫克/升。
[0080] 流加淀粉質原料液化清液和硫酸銨，以及流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、煙酰胺和維生素 B1至發酵罐體積的70%時放料，放料 體積為放料前發酵罐中培養基體積的5%。發酵培養48小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃 度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。
[0081] 實施例3
[0082] 本實施例用于說明本發明提供的賴氨酸的生產方法。
[0083] 種子罐培養基配方、種子罐成熟種子液培養方法、發酵罐培養基配方均與實施例1 相同。
[0084] 發酵罐中的培養基體積為發酵罐體積的60 %。將成熟種子液接入發酵罐的培養基 中進行發酵培養，以接種后的發酵培養基為基準，種子液的接種量為18體積％。接種后連 續流加制得的淀粉質原料液化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質原料液化清液的量使發酵 液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使發酵液中銨根離子的濃度控制 在1. 0-1. 3克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 9立方米空 氣/立方米的培養基/分鐘，并用液氨調節pH維持在7. 4進行發酵培養。分別在發酵培養 4小時后至發酵培養14小時內向發酵液中連續流加 EDTA，流加 EDTA的量使發酵液中EDTA 的濃度控制在10克/升；在發酵14小時后至發酵培養結束前8小時向發酵液中連續流加 磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳，流加磷酸二氫鉀的量使發酵液中磷酸二氫鉀的濃 度控制在0. 8克/升，流加硫酸鎂的量使發酵液中硫酸鎂的濃度控制在0. 4克/升，流加硫 酸亞鐵的量使發酵液中硫酸亞鐵的濃度控制在0. 03克/升，流加硫酸錳的量使發酵液中硫 酸錳的濃度控制在〇. 05克/升；在發酵培養18小時至發酵培養41小時內向發酵液中連續 流加蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加蘇氨酸的量使發酵液中蘇氨酸的濃度控制在〇. 25克/ 升，流加蛋氨酸的量使發酵液中蛋氨酸的濃度控制在0. 35克/升，流加谷氨酸的量使發酵 液中谷氨酸的濃度控制在〇. 4克/升；在發酵培養22小時后至發酵培養48小時內向發酵 液中連續流加生物素、煙酰胺和維生素 B1，流加生物素的量使發酵液中生物素的濃度控制 在〇. 2毫克/升，流加煙酰胺的量使發酵液中煙酰胺的濃度控制在0. 7毫克/升，流加維生 素 B1的量使發酵液中維生素 B1的濃度控制在0. 5毫克/升。
[0085] 流加淀粉質原料液化清液和硫酸銨，以及流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、煙酰胺和維生素 B1培養過程中底料加流加培養基體 積為至發酵罐體積的80%時放料，放料體積為放料前發酵罐中培養基體積的10%。發酵培 養52小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉 化率見表1。
[0086] 對比例1
[0087] 按照實施例3的方法生產賴氨酸，不同的是，在發酵培養基配制中不加入EDTA，并 且在發酵過程中不向發酵液中流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、蘇氨酸、 蛋氨酸、谷氨酸、生物素、煙酰胺和維生素 B1。發酵培養52小時后放罐，測定放罐的賴氨酸 濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。
[0088] 對比例2
[0089] 按照實施例3的方法生產賴氨酸，不同的是，在發酵培養基配制中不加入EDTA，并 且在發酵過程中不向發酵液中流加 EDTA。發酵培養52小時后放罐，測定放罐的賴氨酸濃度 和中間放料的賴氨酸濃度，計算單罐供酸量和轉化率見表1。
[0090] 表 1
[0091]

【權利要求】
1. 一種賴氨酸的生產方法，該方法包括將賴氨酸發酵菌種接入賴氨酸發酵培養基中， 在流加碳源和流加氮源的條件下，進行發酵培養，其特征在于，在發酵培養2-6小時后至發 酵培養12-16小時內向發酵液中流加促進劑，在發酵培養12-16小時后至發酵培養結束前 6-8小時內向發酵液中流加無機鹽，在發酵培養16-20小時后至發酵培養40-42小時內向發 酵液中流加氨基酸，在發酵培養20-24小時后至發酵培養42-48小時內向發酵液中流加維 生素，其中，所述促進劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中的一種或多 種。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述碳源為淀粉質原料液化清液；所述氮源為銨 鹽，所述銨鹽為硫酸銨；所述無機鹽為硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳和磷酸二氫鉀中的一種或 多種；所述氨基酸為蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸中的一種或多種；所述維生素為生物素、煙酰 胺和維生素 B1中的一種或多種。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，流加促進劑的量使發酵液中促進劑的濃度控 制在8-12克/升；流加無機鹽的量使發酵液中無機鹽的濃度控制在0. 01-1. 2克/升，流加 氨基酸的量使發酵液中氨基酸的濃度控制在〇. 1-0. 6克/升，流加維生素的量使發酵液中 維生素的濃度控制在0. 05-1毫克/升。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發酵培 養基為基準，所述賴氨酸發酵菌種的接種量為10-18體積％。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述流加碳源的量使發酵液中還原性糖的濃度 控制在4-10克/升，所述流加氮源的量使發酵液中氮的濃度控制在0. 8-1克/升。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述流加為連續流加。
7. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述發酵培養在發酵罐中進行，接種后且流加碳 源和流加氮源之前發酵罐中的培養基的體積為發酵罐體積的30-60%，當流加碳源和氮源 以及流加所述促進劑、無機鹽、氨基酸和維生素至發酵罐體積的70-80%時放料，放料體積 為放料前發酵罐中培養基體積的5-10%。
8. 根據權利要求1或7所述的方法，其中，發酵培養42-54小時后放罐。
9. 根據權利要求7或8所述的方法，其中，所述方法還包括從所述放料或所述放罐的溶 液中提取賴氨酸。
10. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述發酵培養的條件包括：溫度為35-38°C，壓 力為0· 05-0. IMPa，pH值為6. 7-7. 4,通氣量為0· 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養基/分 鐘。
11. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述賴氨酸發酵菌種為谷氨酸棒桿菌、大腸桿 菌和黃色短桿菌中的至少一種。
【文檔編號】C12R1/19GK104232702SQ201410363392
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】滿云, 陳影, 榮玉鳳, 李長輝 申請人:中糧生物化學（安徽）股份有限公司