一種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法，熒光定量PCR方法采用一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條熒光標(biāo)記的熒光探針和第二條熒光標(biāo)記的熒光探針，兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，第一條熒光探針是用于檢測(cè)細(xì)菌的通用型熒光探針，第二條熒光探針是用于檢測(cè)人工內(nèi)參的內(nèi)參探針，采用常規(guī)的PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)上述方式，本發(fā)明的檢測(cè)方法，適用于血小板制品細(xì)菌污染篩查，可充分解決血小板制品細(xì)菌污染中細(xì)菌有無(wú)、細(xì)菌含量、細(xì)菌死活等問(wèn)題，滿足快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)要求，為血小板安全輸注提供一種科學(xué)、有效的輔助診斷方法。
【專利說(shuō)明】—種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子診斷和檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法。

【背景技術(shù)】
[0002]通過(guò)輸血傳播的病原體主要是病毒、細(xì)菌和原蟲(chóng)等，我國(guó)目前納入血源篩查的項(xiàng)目?jī)H有乙肝、丙肝、艾滋病毒和梅毒螺旋體。在輸血的感染性風(fēng)險(xiǎn)中，細(xì)菌污染和敗血癥性輸血反應(yīng)尚未得到足夠重視。血小板制品必須在(22±2)°C條件下振蕩保存，這種環(huán)境下細(xì)菌污染的概率要高于其他血液成分細(xì)菌污染或病毒感染的概率，因此血小板制品有效保存期很短，一般規(guī)定是24小時(shí)或5天。研究表明，大約每3000單位的血小板制品中就有I個(gè)單位發(fā)生細(xì)菌污染，主要污染來(lái)源是獻(xiàn)血者皮膚菌群，獻(xiàn)血者存在無(wú)癥狀的菌血癥以及在制備過(guò)程中發(fā)生的污染。發(fā)生細(xì)菌污染的血小板制品如果輸注到病人體內(nèi)，幾乎無(wú)例外都要引起輕重程度不等的輸血反應(yīng)，甚至是致命的菌血癥和敗血癥。美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)(AABB)2004年規(guī)定所有血小板制品在輸注前均應(yīng)作細(xì)菌污染檢測(cè)。我國(guó)衛(wèi)生部在2004年專門(mén)討論了血液制品的細(xì)菌安全問(wèn)題，但至今還沒(méi)有關(guān)于血液及血液成分細(xì)菌污染檢測(cè)的相關(guān)法律法規(guī)出臺(tái)。開(kāi)展血小板細(xì)菌污染檢測(cè)，既是為了保證臨床血小板輸注的安全，同時(shí)也是為了充分有效利用有限的血小板資源。
[0003]血小板細(xì)菌污染檢測(cè)技術(shù)主要有三類:細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)、血清學(xué)免疫檢測(cè)、核酸分子檢測(cè)。目前以細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，其中通過(guò)FDA認(rèn)證的有Bact/ALERT細(xì)菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和PalleBDS細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)，均是基于細(xì)菌培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的各種指標(biāo)變化，如消耗的O2、累積的CO2、營(yíng)養(yǎng)成分改變等，這種方法檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，需要I?2天，會(huì)有漏檢的情形發(fā)生。此外，通過(guò)FDA認(rèn)證的PGD試紙條檢測(cè)系統(tǒng)是采用細(xì)菌表面特異性抗原的單克隆抗體床旁快速檢測(cè)血小板制品細(xì)菌污染，但該方法不能作為血小板質(zhì)量控制檢測(cè)方法，敏感性較差，對(duì)一些革蘭氏陰性細(xì)菌不易檢出。Scansystem系統(tǒng)則是利用單抗富集血小板濾過(guò)樣本，對(duì)其中的細(xì)菌DNA用通透劑和熒光劑進(jìn)行標(biāo)記，并用激光掃描確定污染情況，該方法檢測(cè)時(shí)間雖短，但靈敏度不高，最終結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜。目前，國(guó)內(nèi)尚未開(kāi)發(fā)血小板細(xì)菌制品污染相關(guān)的檢測(cè)試劑及儀器。
[0004]核酸檢測(cè)(Nucleic Acid Test，NAT) —般是對(duì)各種病原生物的特異性靶標(biāo)核酸序列進(jìn)行定性、定量分析。在血液及血液制品的篩查和檢測(cè)領(lǐng)域，核酸檢測(cè)已經(jīng)廣泛用來(lái)檢測(cè)樣本是否存在病毒感染，以降低輸血傳播病毒性傳染病的風(fēng)險(xiǎn)。如艾滋、乙肝、丙肝和梅毒(HIV,HBV,HCV,Tp)是血液相關(guān)樣本法定檢測(cè)的四項(xiàng)，目前都采用核酸檢測(cè)或聯(lián)合酶聯(lián)免疫檢測(cè)的方法進(jìn)行確認(rèn)。核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)主要是從PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增)技術(shù)發(fā)展而來(lái)，其中的PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。
[0005]熒光定量PCR是從PCR技術(shù)發(fā)展而來(lái)，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，可實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，省略普通PCR的后續(xù)鑒定步驟，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量。熒光定量PCR檢測(cè)已經(jīng)在臨床疾病診斷，優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)，動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫，食品安全，科學(xué)研究等不同領(lǐng)域得到應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法，該方法檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、可靠。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法，所述熒光定量PCR方法采用一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條突光標(biāo)記的突光探針和第二條突光標(biāo)記的突光探針，所述兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，所述第一條熒光探針是用于檢測(cè)細(xì)菌的通用型熒光探針，所述第二條熒光探針是用于檢測(cè)人工內(nèi)參的內(nèi)參探針，采用常規(guī)的PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0008]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物為T(mén)TGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一條熒光探針為CR6_probe探針，所述CR6_probe探針為 6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 202 bp。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為CR6-F上游引物和CR8-R下游引物，所述CR6-F上游引物為T(mén)TAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R下游引物為GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一條熒光探針為CR7_probe探針，所述CR7_probe探針為 6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 291 bp。
[0010]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為CR7-F上游引物和CR9-R下游引物，所述CR7-F上游引物為GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R下游引物為T(mén)GACGTCITCCCCACCTTC，所述第一條熒光探針為CR8-probe探針，所述CR8_probe探針為 6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 243 bp。
[0011]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為23S3⑶-F上游引物和23S3⑶-R下游引物，所述23S3⑶-F上游引物為CTCAACGGATAAAAGITAC，所述23S3CD-R下游引物為GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一條熒光探針為23S3CD -probe探針，所述 23S3CD -probe 探針為 6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQl，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 189
bp ο
[0012]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述人工內(nèi)參采用基因合成方式制備，兩端序列和所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物完全匹配，中間80bp的序列和內(nèi)參探針是人工設(shè)計(jì)的，與任何細(xì)菌及人類基因組沒(méi)有任何相關(guān)性，所述人工內(nèi)參的結(jié)構(gòu)為5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補(bǔ)序列3’。
[0013]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述人工內(nèi)參加入到檢測(cè)樣本中，可設(shè)為最低檢出限或任意閾值，也可作為標(biāo)準(zhǔn)品，具有對(duì)檢測(cè)結(jié)果提供質(zhì)控、判讀、定量參照功能。
[0014]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述熒光定量PCR方法中通過(guò)反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)樣本中的RNA，與人工內(nèi)參和相應(yīng)DNA的Ct值進(jìn)行比較，判斷細(xì)菌是否為活性菌。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法，該方法只用一對(duì)引物，兩種探針就能完成血小板細(xì)菌污染的檢測(cè)，其人工內(nèi)參除了具有一般內(nèi)參功能外，還可作為標(biāo)準(zhǔn)品使用，解決了目前血小板制品細(xì)菌污染缺少標(biāo)準(zhǔn)品的問(wèn)題，也使得核酸檢測(cè)用于血小板制品細(xì)菌污染篩查成為可能。本發(fā)明對(duì)常規(guī)熒光定量PCR方法進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，使其更適用于血小板制品細(xì)菌污染篩查，可充分解決血小板制品細(xì)菌污染中細(xì)菌有無(wú)、細(xì)菌含量、細(xì)菌死活等問(wèn)題，以及滿足快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)要求，為血小板安全輸注提供一種科學(xué)、有效的輔助診斷方法。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明的通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法的原理過(guò)程圖；
圖2是血小板細(xì)菌污染中細(xì)菌種類的統(tǒng)計(jì)圖；
圖3是計(jì)算機(jī)分析相關(guān)引物、探針在26種細(xì)菌中的匹配性圖；
圖4是CR5-F和CR7-R引物對(duì)細(xì)菌和人基因組的擴(kuò)增特異性圖；
圖5是熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌DNA的信號(hào)圖；
圖6是人工內(nèi)參的檢測(cè)限與樣本檢測(cè)Ct值間的差異與判讀圖；
圖7是反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌RNA的Ct值比較圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明是基于熒光定量PCR方法檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的，所述熒光定量PCR方法設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條熒光標(biāo)記的熒光探針和第二條熒光標(biāo)記的熒光探針。一對(duì)引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，一條熒光探針用于檢測(cè)細(xì)菌靶標(biāo)，另一條熒光探針是內(nèi)參探針，用于內(nèi)部質(zhì)量控制以及定量參照。
[0019]所述熒光定量PCR方法采用以上設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)有:(I)只用一對(duì)引物就能完成靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增，不同一般靶標(biāo)和內(nèi)參分別需要不同引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)化了整個(gè)PCR反應(yīng)，減少引物過(guò)多引起的非特異性假陽(yáng)性問(wèn)題。(2)建立人工內(nèi)參作為標(biāo)準(zhǔn)品，由于污染血小板的細(xì)菌種類各異，一般情況是不存在血小板細(xì)菌污染的標(biāo)準(zhǔn)品，本發(fā)明的人工內(nèi)參既可作為血小板細(xì)菌污染檢測(cè)樣本的標(biāo)準(zhǔn)品，也可作為熒光PCR反應(yīng)的內(nèi)部質(zhì)量控制以及定量參照。用內(nèi)參作為最小檢出限時(shí)，只有Ct (檢測(cè))=Ct (內(nèi)參)，才能確保檢測(cè)樣本陽(yáng)性，避免假陽(yáng)性；用內(nèi)參作為絕對(duì)定量參照時(shí)，可在檢測(cè)不同樣本的同時(shí)制作統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)既可作為反應(yīng)質(zhì)控內(nèi)標(biāo)，也可作為定量標(biāo)準(zhǔn)樣品；(3)檢測(cè)樣本和內(nèi)參可在同一個(gè)反應(yīng)體系里進(jìn)行，不同于一般核酸檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本分開(kāi)在不同反應(yīng)體系中，本發(fā)明設(shè)計(jì)可以更好發(fā)揮熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)，減少一般情形下標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣需放在不同反應(yīng)體系所造成的人為或系統(tǒng)誤差。
[0020]請(qǐng)參閱圖2，血小板制品中可能污染的細(xì)菌種類有很多，研究發(fā)現(xiàn)，污染血小板的主要細(xì)菌屬種為:葡萄球菌屬(表皮葡萄球菌、金黃葡萄球菌)占27%，鏈球菌屬(化膿鏈球菌，溶血性鏈球菌)占12%，假單胞菌屬(銅綠假單胞菌，鼻疽假單胞菌)占9%，棒桿菌屬(白喉?xiàng)U菌，蠟狀芽孢桿菌，皮膚丙酸桿菌，莢膜梭狀桿菌，變性桿菌)占14%，腸科細(xì)菌(乳酸菌，腸球菌)占8%，傷寒沙門(mén)氏菌占8%，粘質(zhì)沙雷氏菌占7%，大腸埃希菌占6%，腸結(jié)炎耶爾森氏菌占3%，肺炎克雷伯氏菌占4%，這些細(xì)菌占了 97%以上。資料來(lái)源:Murphy MF和PamphilonDH 所著《Practical Transfus1n Medicine)) (2009,第 3 版，pl46_152) 一書(shū)。
[0021]在檢測(cè)血小板制品細(xì)菌污染的實(shí)踐中，一般情形下，并不需要對(duì)每種細(xì)菌都進(jìn)行檢測(cè)，只需能區(qū)分有無(wú)細(xì)菌污染的發(fā)生即可。因此，本發(fā)明以在人類基因組中不存在，但在細(xì)菌進(jìn)化中高度保守的共有核酸序列作為細(xì)菌通用型檢測(cè)靶標(biāo)，如16S rDNA或23S rDNA，這2個(gè)基因存在于所有細(xì)菌染色體基因中，通常作為細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中的靶標(biāo)，具有良好的分子鐘性質(zhì)，進(jìn)化上高度保守，可稱為“細(xì)菌化石”。
[0022]本發(fā)明在16S rDNA和23S rDNA基因中選擇了合適區(qū)域設(shè)計(jì)相關(guān)檢測(cè)引物和探針:
(I)16S rDNA作為細(xì)菌通用型特異性檢測(cè)祀標(biāo),在其不同恒定區(qū)(constant reg1n,CR)設(shè)計(jì)了 3套引物和探針:
①在恒定區(qū)5和恒定區(qū)7分別設(shè)計(jì)上下游引物，探針設(shè)計(jì)在恒定區(qū)6，擴(kuò)增范圍包括CR5-VR5-CR6-VR6-CR7:
CR5-F 上游引物:GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA ；
CR7-R 下游引物:TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG ；
CR6-probe 探針:6FAM-CAGGATTAGATACCCTG_BHQ1 ；
擴(kuò)增產(chǎn)物大小:202 bp。
[0023]②在恒定區(qū)6和恒定區(qū)8分別設(shè)計(jì)上下游引物，探針設(shè)計(jì)在恒定區(qū)7，擴(kuò)增范圍包括 CR6-VR6-CR7-VR7-CR8:
CR6-F 上游引物:TTAGATACCCTGGTAGTCCA ；
CR8-R 下游引物:GAGCTGACGACAICCITGC ；
CR7-probe 探針:6FAM_ ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1 ；
擴(kuò)增產(chǎn)物大小:291 bp。
[0024]③在恒定區(qū)7和恒定區(qū)9分別設(shè)計(jì)上下游引物，探針設(shè)計(jì)在恒定區(qū)8，擴(kuò)增范圍包括 CR7-VR7-CR8-VR8-CR9:
CR7-F 上游引物:GCAACGCGAAIAACCTTACC ；
CR9-R 下游引物:TGACGTCITCCCCACCTTC ；
CR8-probe 探針:6FAM_ TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1 ；
擴(kuò)增產(chǎn)物大小:243 bp。
[0025](2) 23S rDNA作為細(xì)菌特異性檢測(cè)靶標(biāo)，在其3端的高度保守恒定區(qū)里設(shè)計(jì)引物和探針:
23S3CD-F 上游引物:CTCAACGGATAAAAGITAC ；
23S3CD-R 下游引物:GACCIAACTGTCTCACGAC ；
23S3CD -probe 探針:6FAM_ TGTCGGCTCITCICATCCT -BHQl ；
擴(kuò)增產(chǎn)物大小:189 bp。
[0026]上述4套引物和探針經(jīng)過(guò)對(duì)26種經(jīng)報(bào)道的常見(jiàn)血小板污染細(xì)菌相關(guān)核酸序列進(jìn)行計(jì)算比對(duì)，結(jié)果顯示出良好的匹配性和特異性。個(gè)別位置不一致的核苷酸序列，在引物合成中通過(guò)換成次黃嘌呤(I)堿基則可以與任意四種ATGC堿基互補(bǔ)，第I套引物、探針的比對(duì)結(jié)果如圖3所示，其他幾套引物比對(duì)結(jié)果也是如此。由于這26種細(xì)菌在統(tǒng)計(jì)中，基本覆蓋已經(jīng)報(bào)道并鑒定的血小板污染細(xì)菌，覆蓋率大于97%以上，因此這些引物和探針具有非常高的檢測(cè)血小板污染細(xì)菌的通用性。盡管如此，我們還將這些引物序列在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行了搜索比對(duì),結(jié)果顯示和各種細(xì)菌微生物吻合，但沒(méi)有一例真核生物的匹配結(jié)果。在下面實(shí)施例里，也證實(shí)在人類基因中沒(méi)有檢出。
[0027]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一套獨(dú)特的人工內(nèi)參系統(tǒng)，在通常血小板細(xì)菌污染沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，這套人工內(nèi)參的作用更加突出。這套人工內(nèi)參采用基因合成方式制備，兩端序列和檢測(cè)用的上下游引物完全匹配，中間80bp的序列以及內(nèi)參探針是人工設(shè)計(jì)的，與任何細(xì)菌以及人類基因組均沒(méi)有任何相關(guān)性。
[0028]人工內(nèi)參的結(jié)構(gòu)是5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補(bǔ)序列3’，以16S rDNA第①套引物為實(shí)施例，人工內(nèi)參的序列是:5 ’ GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGAGCAGGGCCAGGCCTGCCAGTTCTACAGCCTGCTTGGAACTGGCCGTCTTCCAGGATAGAAGTAACTTGGTGTCTGACAGTCCGCCTGGGGAITACGGICGCAA3’，其中 GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA 序列為上游引物，CCGCCTGGGGAITACGGICGCAA 為下游引物(TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG)的互補(bǔ)序列，而CCTGCTTGGAACTG 序列是內(nèi)參探針:HEX_ CTGCTTGGAACTG-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 125bp。
[0029]本發(fā)明作為常規(guī)的熒光定量PCR可以檢測(cè)細(xì)菌的DNA是否在血小板制品中存在，同時(shí)本發(fā)明可增加反轉(zhuǎn)錄步驟作為RT-熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌的RNA是否存在，從而評(píng)估血小板細(xì)菌污染中的細(xì)菌是否為活菌。
[0030]實(shí)踐中，一些血小板制品經(jīng)過(guò)輻照處理，大部分細(xì)菌已經(jīng)死亡，它們的DNA仍然存在于血小板中，常規(guī)熒光定量PCR可以檢出這些極少量的細(xì)菌DNA，如何評(píng)價(jià)這些極少量細(xì)菌污染的血小板制品中，是否存在繁殖活躍的細(xì)菌，則可通過(guò)反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR進(jìn)行細(xì)菌RNA檢測(cè)，由于細(xì)菌RNA在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)大量轉(zhuǎn)錄，而細(xì)菌死亡后，RNA會(huì)迅速被降解，很少殘留，因此活菌中RNA的檢出量會(huì)顯著高于DNA，即Ct (RNA) < Ct (DNA) ( Ct (內(nèi)參)，而死菌中RNA的檢出量會(huì)小于DNA，甚至是內(nèi)參。
[0031]所用試劑和儀器:選用第①套引物和探針，CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA, CR7-R 下游引物為 TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，CR6_probe 探針為 6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，內(nèi)參為 GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGAGCAGGGCCAGGCCTGCCAGTTCTACAGCCTGCTTGGAACTGGCCGTCTTCCAGGATAGAAGTAACTTGGTGTCTGACAGTCCGCCTGGGGAITACGGICGCAA，內(nèi)參探針為HEX- CTGCTTGGAACTG-BHQ1,引物、探針和內(nèi)參均在上海生工合成。PCR反應(yīng)試劑為國(guó)產(chǎn)近岸生物產(chǎn)品，雙蒸水，TE緩沖液，ABI 7500熒光定量PCR儀，國(guó)產(chǎn)基因組DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒，qPCR用8聯(lián)管耗材。
[0032]樣本:人全血樣本、大腸桿菌、芽孢桿菌。
[0033]實(shí)施例一:CR5_F和CR7-R引物對(duì)細(xì)菌和人基因組的特異性干粉引物和探針用TE緩沖液溶解到10 μ M ;人基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA用試劑盒進(jìn)行提取，并用微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量；常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，30 μ L反應(yīng)體系，包括:
2Χ 預(yù)混 PCR Mix Buffer15 μ L
0?54上游引物(1(^]\0I μ L
0?7-1?下游引物(1(^]\0I μ L
基因組模板(50?10ng)I UL
雙蒸水補(bǔ)足12 μ L0
[0034]反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性，5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C孵育5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，記錄結(jié)果，如圖4顯示，這對(duì)引物只擴(kuò)增細(xì)菌基因組，對(duì)人類基因組沒(méi)有特異性。
[0035]實(shí)施例二:熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌DNA
實(shí)施例并沒(méi)有使用血小板制品樣本進(jìn)行檢測(cè)，而是用人全血基因組和細(xì)菌基因組單獨(dú)或混合來(lái)模擬，以人基因組作為陰性對(duì)照，以人基因組混合梯度稀釋的細(xì)菌基因組作為檢測(cè)樣本，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，30 μ L反應(yīng)體系，包括:
2Χ 預(yù)混 PCR Mix Buffer15 μ L
0?54上游引物(1(^]\0I μ L
0?7-1?下游引物(1(^]\0I μ L
0?6-?1"必6探針(1(^]\00.5 μ L
內(nèi)參探針(10 μ Μ)0.5 yL
基因組模板(50?10ng)I UL
人工內(nèi)參(稀釋至約100拷貝) I yL 雙蒸水補(bǔ)足10 μ L0
[0036]反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性，2min ;95°C變性20s，60°C退火、延伸及熒光檢測(cè)lmin，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖5顯示，CR6-pix)be探針只在檢測(cè)樣本中有信號(hào)(圖中①-④)，在陰性對(duì)照中無(wú)信號(hào)，而內(nèi)參探針在所有樣本中均有熒光信號(hào)(圖中⑤)，說(shuō)明無(wú)論是檢測(cè)探針還是內(nèi)參探針都有很好的特異性。
[0037]實(shí)施例三:人工內(nèi)參的檢測(cè)限與樣本檢測(cè)Ct值間的差異與判讀
在該實(shí)施例中，人工內(nèi)參由基因合成每OD約33ug的量，人工內(nèi)參的分子數(shù)為38881.9，換算成拷貝數(shù)進(jìn)行梯度稀釋，通過(guò)熒光定量PCR可以確定在本實(shí)施例條件下(包括試劑，耗材，儀器，操作等因素)，能檢測(cè)的內(nèi)參最低限是20拷貝數(shù)。培養(yǎng)的大腸桿菌用可見(jiàn)光分光光度檢測(cè)其OD6tltl值，在OD6qq=L O時(shí)，ImL培養(yǎng)液中約有6.3xl08個(gè)活菌，進(jìn)行相應(yīng)的梯度稀釋，拿50 μ L稀釋液在95°C裂解20分鐘，離心后取I μ L稀釋液作為模版進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，最后可檢測(cè)的細(xì)菌最小范圍是5?15個(gè)菌/mL濃度。人工內(nèi)參的檢測(cè)限與樣本檢測(cè)Ct值的差異與判讀的結(jié)果如圖6所示:1、細(xì)菌量濃度>25個(gè)/mL時(shí)，Ct (檢測(cè))明顯小于Ct (內(nèi)參)，表明在實(shí)施例條件下，檢測(cè)結(jié)果是可保證的；2、細(xì)菌量濃度在15個(gè)/mL、10個(gè)/mL時(shí)，Ct (檢測(cè))和Ct (內(nèi)參)差異不明顯，表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，樣本中細(xì)菌載量接近最低檢測(cè)限，結(jié)果可設(shè)為疑似或排除；而細(xì)菌量濃度在5個(gè)/mL時(shí)，Ct (檢測(cè))大于Ct (內(nèi)參)，結(jié)果可排除為假陽(yáng)性。
[0038]實(shí)施例四:反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌RNA 在目前血小板輸注實(shí)踐中，并不可能要求血小板制品完全無(wú)菌，因?yàn)橥ㄟ^(guò)FDA認(rèn)證的檢測(cè)系統(tǒng)，它們的細(xì)菌最低檢出限都達(dá)不到10個(gè)菌/mL，比如Bact/ALERT和PalleBDS的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)限在12?13個(gè)菌/mL范圍，而基于免疫方法的PGD檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限要> 13個(gè)菌/mL。而從實(shí)施例三可以看出熒光定量PCR核酸檢測(cè)細(xì)菌的最低檢出限很容易達(dá)到12個(gè)菌/mL范圍內(nèi)，由此更可以說(shuō)明人工內(nèi)參的重要作用，它可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行閾值設(shè)定幫助判讀樣品檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明還提出通過(guò)反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌RNA，可對(duì)一些細(xì)菌載量在12個(gè)菌/mL范圍的樣品進(jìn)行細(xì)菌活性評(píng)估。
[0039]同實(shí)施例三一樣，對(duì)培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行濃度測(cè)定，梯度稀釋后取兩份含12個(gè)菌左右的100 μ L樣品，其中一份樣品在70°C下孵育30min使細(xì)菌完全死亡，然后分別提取兩份樣品的總RNA，作為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)以相同菌數(shù)的樣本DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，50 μ L反應(yīng)體系，包括:
1X one step RT-PCR Buffer5 μ L
dNTPs (1mM)4 yL
0?54上游引物(1(^]\0I μ L
0?7-1?下游引物(1(^]\0I μ L
0?6-?1"必6探針(1(^]\00.5 μ L
內(nèi)參探針(ΙΟμΜ)0.5 μ L
總 RNA (100 ?300ng)I μ L
人工內(nèi)參(稀釋至約100拷貝)I yL
反轉(zhuǎn)錄酶I μ L
Taq 酶IyL
雙蒸水補(bǔ)足34 μ L0
[0040]反應(yīng)條件:42°C反轉(zhuǎn)錄，50min ;75°C終止反轉(zhuǎn)錄，15min ;95°C預(yù)變性，2min ；95°C變性20s，60°C退火、延伸及熒光檢測(cè)lmin，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖7顯示，未經(jīng)處理就提取RNA的樣本，可以檢測(cè)到熒光信號(hào)，其Ct (檢測(cè))明顯小于Ct (內(nèi)參);而經(jīng)過(guò)滅活處理后提取的RNA樣本中，其Ct (檢測(cè))值大于Ct (內(nèi)參)；陽(yáng)性對(duì)照樣本Ct (檢測(cè))處于兩個(gè)RNA樣本的Ct (檢測(cè))值之間。說(shuō)明滅活后的細(xì)菌，其RNA會(huì)迅速降解，在反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)中可能測(cè)不出或者得到很大的Ct值。
[0041]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種通用型檢測(cè)血小板細(xì)菌污染的熒光定量PCR方法，其特征在于，所述熒光定量PCR方法采用一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內(nèi)參、第一條熒光標(biāo)記的熒光探針和第二條熒光標(biāo)記的熒光探針，所述兩條熒光探針采用不同的熒光標(biāo)記，所述第一條熒光探針是用于檢測(cè)細(xì)菌的通用型熒光探針，所述第二條熒光探針是用于檢測(cè)人工內(nèi)參的內(nèi)參探針，采用常規(guī)的PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物為T(mén)TGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一條熒光探針為CR6_probe探針，所述 CR6-probe 探針為 6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 202 bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為CR6-F上游引物和CR8-R下游引物，所述CR6-F上游引物為T(mén)TAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R下游引物為GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一條熒光探針為CR7-probe探針，所述CR7-probe 探針為 6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 291 bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為CR7-F上游引物和CR9-R下游引物，所述CR7-F上游引物為GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R下游引物為T(mén)GACGTCITCCCCACCTTC，所述第一條熒光探針為CR8-probe探針，所述CR8-probe 探針為 6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 243 bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物為23S3⑶-F上游引物和23S3⑶-R下游引物，所述23S3⑶-F上游引物為CTCAACGGATAAAAGITAC,所述 23S3CD-R 下游引物為 GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一條熒光探針為 23S3CD -probe 探針，所述 23S3CD -probe 探針為 6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT-BHQl，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為189 bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述人工內(nèi)參采用基因合成方式制備，兩端序列和所述一對(duì)檢測(cè)細(xì)菌的通用型引物完全匹配，中間80bp的序列和內(nèi)參探針是人工設(shè)計(jì)的，與任何細(xì)菌及人類基因組沒(méi)有任何相關(guān)性，所述人工內(nèi)參的結(jié)構(gòu)為5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補(bǔ)序列3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述人工內(nèi)參加入到檢測(cè)樣本中，可設(shè)為最低檢出限或任意閾值，也可作為標(biāo)準(zhǔn)品，具有對(duì)檢測(cè)結(jié)果提供質(zhì)控、判讀、定量參照功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光定量PCR方法中通過(guò)反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)樣本中的RNA，與人工內(nèi)參和相應(yīng)DNA的Ct值進(jìn)行比較，判斷細(xì)菌是否為活性菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372072SQ201410363658
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】蒙青林, 李勇, 田晶晶, 魏雙施, 王紅梅, 段生寶, 丁少華, 陳曄洲, 李冬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所