專利名稱：檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種診斷家蠶及其它昆蟲微粒子病(Nosema屬)的方法和試劑盒。更具體地，本發明涉及一種通過檢測昆蟲樣品中是否存在微粒子16S小亞基rRNA基因而檢測昆蟲微粒子病的方法及其診斷試劑盒。
當前家蠶微粒子病檢測、診斷最為有效的方法是巴斯德在19世紀80年代建立的母蛾鏡檢法，100多年來一直沿用至今。該方法是指在蠶種制種時，將已產過卵的母蛾研碎后在顯微鏡下直接觀察是否有微粒子孢子存在，以確定其產下的蠶卵是否感染微粒子病，對其它昆蟲的微粒子病，多采用類似母蛾檢測法的方法，即把待檢測的蟲體研碎后在顯微鏡下直接觀察是否有微粒子的孢子。雖然母蛾鏡檢法或其它鏡檢法在生產上非常實用有效，但受到方法本身的局限，存在相當多的問題，影響檢測效果，如檢驗人員業務素質、經驗不一，只能在蛾期或發病后期進行檢測，檢測的靈敏度不高、效率低下等等。
20世紀80年代隨著生物技術的發展，相繼出現了雙向免疫擴散法，凝集法，熒光抗體法，酶聯免疫吸附法，酶標抗體法，免疫過氧化物酶染色法，單克隆抗體法等一系列基于微粒子表面抗原蛋白和抗體特異性反應的免疫學技術，被應用到家蠶微粒子病的檢測診斷上，取得了一定的進步，但是由于這些方法交叉反應高，技術復雜，對不同種或亞種的微粒子要制備不同的抗體，并且應用成本高，周期長，對檢驗人員實驗技能要求高等原因，所以至今未得到大規模推廣應用。
聚合酶鏈式反應(PCR)是利用一對特定的引物，將極微量的DNA模板中一段序列快速特異性成百萬倍地擴增，理論上一個DNA模板分子通過PCR擴增即可達到各種檢測手段的要求，是一種早期檢測診斷微粒子病的理想手段。目前已有一些利用PCR技術檢測診斷微粒子病的嘗試，但是離實際應用還有相當的距離，主要原因是由于模板DNA制備繁瑣復雜，成本高；檢測范圍狹窄，多數只能檢測一株或幾株微粒子(Nosemabombycis)，而忽視了大量可以感染昆蟲的其它Nosema屬微粒子的存在和檢測；沒有進行微粒子病的早期(卵期)診斷等。如現有的家蠶微粒子病的PCR診斷技術(陳秀等，1996，蠶業科學，22(4)229-234；蔡仲平，1997，蠶業科學，23(4)207-210)，將活家蠶加液氮勻漿后，加入蛋白酶K消化，酚∶氯仿抽提制備PCR模板的DNA，利用他們設計的特定引物，對模板DNA進行PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。但是該微粒子檢測技術其PCR引物設計只針對家蠶微粒子，僅能檢測出1-2種微粒子，沒有涉及其它昆蟲的微粒子，沒有嘗試微粒子病的早期檢測。該方法在應用中需要蛋白酶K消化，液氮勻漿等步驟使得實驗成本很高，并且DNA模板的制備還涉及多步離心，相轉移等過程使得該方法繁瑣、耗時長，因此現有的這種微粒子病的PCR診斷技術實用性不強，無商業價值。
本發明的另一個目的是提供一種用于昆蟲微粒子病(Nosema屬)的診斷試劑盒。
本發明提供的昆蟲微粒子病PCR診斷方法包括如下步驟(a)制備待測昆蟲樣品PCR反應模板昆蟲樣品放入DNA提取液中，搗碎混勻，加入DNA抽提液，離心，取上清液DNA模板；DNA提取液包括1-100mM的二價金屬離子螯合劑和0.1％-5％(W/V)的去垢劑，并且用堿性物質將提取液的pH值調至11-14；；(b)檢測16S小亞基rRNA基因的特異性引物和步驟(a)中模板，在特異性擴增條件下進行PCR擴增；(C)對步驟(b)的擴增產物進行電泳檢測，根據電泳結果判斷16S小亞基rRNA基因的存在與否。其中(a)中DNA提取液的堿性物質優選NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液，更優選NaOH溶液。DNA抽提液優選苯酚氯仿溶液。二價金屬離子螯合劑優選EDTA或EGTA，更優選EDTA，優選濃度為5-20mM的二價金屬離子螯合劑，更優選10mmol/L的EDTA。去垢劑優選SDS，Triton X-100或Tween 80，更優選SDS，優選濃度為0.5-2％(W/V)的去垢劑，更優選1％的SDS。(b)中所用的16S小亞基rRNA基因的特異性引物優選為A引物，即引物15’GTT GAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；或B引物，即引物1’5’CCT GTATGA TGA TCG ATG CAG3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。(c)中的電泳優選0.5％-2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳。在本發明的另一個方面，提供一種檢測昆蟲微粒子病的試劑盒，該試劑盒包括(a)制備DNA模板所需的提取液試劑包括1-100mM的二價金屬離子螯合劑和0.1-5％(W/V)的去垢劑，并且用堿性物質將提取液的pH值調至11-14；(b)檢測16S小亞基rRNA基因的特異性引物和PCR擴增所需的試劑；其中(a)中DNA提取液的堿性物質優選NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液，更優選NaOH溶液。二價金屬離子螯合劑優選EDTA或EGTA，更優選EDTA，優選濃度為5-20mM的二價金屬離子螯合劑，更優選10mmol/L的EDTA。去垢劑優選SDS，Triton X-100或Tween 80，更優選SDS，優選濃度為0.5-2％(W/V)的去垢劑，更優選1％(W/V)的SDS。(b)中所用的16S小亞基rRNA基因的特異性引物優選為A引物，即引物15’GTT GAT TCTGCC TGA GGT AGA CGC T3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；或B引物，即引物1’5’CCT GTA TGA TGA TCG ATG CAG3’，引物25’CAATGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。進一步優選試劑盒中PCR擴增所需的試劑中加入包括滅菌的礦物油。
本發明的PCR擴增條件是先92℃-97℃(優選94℃)初始變性5分鐘；然后以92-97℃(優選94℃)30秒，52-57℃(優選55℃)30秒，71-73℃(優選72℃)30秒，進行28-35個(優選30個)循環；最后71-73℃(優選72℃)延伸5-10分鐘。
“PCR擴增所需的試劑”是指將模板中的極微量的基因進行PCR擴增反應過程所用的試劑，包括dNTP、耐高溫DNA聚合酶、10×酶緩沖液和雙蒸水等。
所用的樣品可以是含有待測昆蟲基因的任何組織、體液或血液等，通常使用的是整個蟲體。
本發明以PCR技術為主要實驗手段，根據微粒子(Nosema屬)基因組中16S小亞基rRNA基因序列中高度保守的DNA序列，設計檢測16S小亞基rRNA基因的特異性引物。
16S小亞基rRNA基因(Nosema sp.)序列為caccaggttg attctgcctg acgtagacgc tattccctaa gattaaccca tgcatgtttt 60tgatatggaa aaatggactg ctcagtaata ctcactttat ttaatgtatt aaattagtat120aactgcgtta aagtgtagca taagacatat acagtaagag tgagacctat cagctagttg180ttaaggtaat ggcttaacaa ggcaatgacg ggtgacggta ttactttgta atattccgga240gaaggagcct gagagacggc tactaagtct aaggattgca gcaggggcga aacttgacct300atggatttta tctgaggcag ttatgggaag taatattcta ttgtttcata ttgtaaaagt360atatgagatg attaattgga gggcaaatca agtgccagca gccgcggtaa tacttgttcc420aagagtgtgt atgatgattg atgcagttaa aaagtccgta gtttatattt aagaagcaat480atgaggtgta ctgtatagtt gggagagaga tgaaatgtga cgaccctgac tggacgaaca540
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為了進行PCR擴增，通常認為需要用蛋白酶K對樣品進行消化，以去除和DNA結合的蛋白，釋放出DNA。本發明在模板的制備上無需蛋白酶K消化，通過堿、螯合劑和去垢劑組成的消化液破碎細胞和微粒子的孢子，釋放DNA，并在實驗設計上進一步簡化了已有的提取DNA模板的步驟；不僅降低了提取成本，而且更加簡便快速。
將本發明的檢測方法采取商品化處理，做成試劑盒，試劑盒包含制備DNA模板所需的提取液試劑，PGR反應所需的試劑；可在PCR反應所需的試劑中滴加少量滅菌的礦物油，即可在冰箱中冷凍保存，有效期可達1年以上。按說明書的操作方法，將樣品加入到提取液試劑中，搗碎混勻后加入自配的同體積的苯酚氯仿抽提液，10000rpm離心5分鐘；取少量上清加入到PCR反應試劑中，進行PCR擴增；擴增產物進行電泳檢測即可鑒定出樣品中是否被Nosema屬微粒子感染。檢測微粒子病時，只有加入模板DNA樣品的一次加樣步驟，大大簡化了加樣操作，縮短了加樣時間，減少了交叉污染的機會。
本發明的方法和試劑盒均可方便準確的鑒定出Nosema屬微粒子，和現有的實驗室所用的微粒子病的PCR診斷技術相比具有如下優點1.模板制備簡便，成本低(約為現有的診斷技術成本的10％)，耗費的反應時間少(本發明模板提取時間約為1小時，現有的診斷方法提取時間約為6小時)。
2.特異性強(只針對微粒子Nosema屬有效)、廣譜性高(可檢測多種昆蟲微粒子病)，并能檢測出發病早期的感染昆蟲。
C.感染家蠶微粒子的家蠶 D.感染甜菜夜蛾微粒子的甜菜夜蛾D.感染粘蟲微粒子的粘蟲 F.感染粘蟲微粒子的中紅側溝繭蜂
(2)PCR反應PCR反應體系如下DNA模板 1μL10×Taq酶緩沖液 2.5μLdNTP(10mM) 1μL引物1(10pM) 1μL引物2(10pM) 1μLTaq酶(2U)0.5μL雙蒸水 20.8μLTaq酶緩沖液為50mM Tris-HCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，1％Triton X-100，50％甘油，pH8.0。所用的引物為A引物(引物15’GTTGAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACCTTC G 3’)。
用PCR儀進行PCR反應，反應條件為94℃5分鐘 72℃10分鐘(3)PCR反應產物的檢測取5μL PCR反應產物，用瓊脂糖凝膠(凝膠濃度0.8％，電壓40伏，電泳20分鐘，視電泳槽、電泳儀等具體情況而定)電泳檢測。
電泳結果如

圖1所示，DNA分子量標準的電泳條帶分別代表300bp，400bp，500bp，600bp，700bp和800bp長度的DNA片段，感染微粒子病的家蠶(A)和陽性對照(B)在600bp附近有陽性條帶，而健康家蠶則沒有(C)，說明本發明的方法能有效檢測出家蠶的微粒子病。
實施例2本方法檢測棉鈴蟲感染微粒子病實驗(1)DNA模板的提取方法基本同實施例1，只是樣品為感染微粒子病的棉鈴蟲，提取液為2％的Tween 80和10mmol/L的EGTA，pH＝11(KOH調)。
(2)PCR反應方法同實施例1，只是引物改為B引物(引物1’5’CCT GTA TGA TGATCG ATG CAG3’，引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’)。
(3)PCR反應產物的電泳檢測方法同實施例1。
本方法可以有效地檢出感染微粒子的棉鈴蟲。電泳結果如圖2。感染微粒子病的棉鈴蟲有明顯的電泳條帶，健康棉鈴蟲則沒有電泳帶。
實施例3本試劑盒檢測微粒子靈敏度實驗本實驗采用常規的DNA模板的提取方法，將提取出來的DNA定量，用本發明所述的PCR方法擴增DNA，電泳檢測本發明所用的PCR方法的靈敏度。
(1)DNA模板的提取常規的DNA模板提取方法同文獻(陳秀等，1996，蠶業科學，22(4)229-234)。
將活家蠶樣品加液氮勻漿后，加入蛋白酶K液(蛋白酶K 50μg/ml，0.01M Tris，pH7.8，0.005M EDTA，0.5％(W/V)SDS)，50℃消化3小時。在樣品中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻管中內容物使之成為乳濁液，室溫下離心15秒(12,000g)，把水相轉移到另一離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，室溫下離心15秒(12,000g)，把水相轉移到另一離心管中，加入十分之一的3M的乙酸鈉，充分混勻，加入2倍體積的冷乙醇，混勻后低溫下30分鐘，0℃下12,000g離心10分鐘，加入管容量一半的70％的乙醇，清洗后，離心除去乙醇，在室溫下，讓離心管內液體揮發，用適量TE溶解DNA，獲得模板DNA。
家蠶微粒子DNA經梯度稀釋后為模板(DNA模板含量分別為200ng，100ng，50ng，25ng，12.5ng，6.24ng，3.13ng，1.57ng)對照CK以健康家蠶為樣品經上述常規方法提取DNA，用以進行PCR反應的DNA模板含量是1160ng。
(2)PCR反應方法同實施例1。
(3)PCR反應產物的檢測方法同實施例1。
結果從圖3可以看出本試劑盒檢測的靈敏度至少可達1.57ng。
實施例4家蠶口服微粒子后不同時間的微粒子病的檢測用家蠶微粒子伺喂家蠶，從1天后開始取樣，逐日取樣至第八天，作為本實施例所用的樣品，檢測本發明的方法在第幾日開始能夠檢測出微粒子病家蠶。
分別用第1天至第8天的家蠶作為樣品制備DNA模板，模板用于PCR反應，電泳檢測擴增產物，方法均同實施例1。
結果伺喂微粒子3天后即可檢出家蠶感染微粒子，此時感染的微粒子在家蠶體內還沒有形成孢子，因此顯微鏡下觀察不到微粒子孢子，也就是說，用傳統的鏡檢方法并不能判定此時的家蠶樣品是否感染微粒子病，說明本發明可以對微粒子病進行早期檢測。實施例5本試劑盒應用廣譜性實驗樣品A.家蠶微粒子DNAB.健康家蠶DNAC.感染家蠶微粒子的家蠶D.感染甜菜夜蛾微粒子的甜菜夜蛾E.感染粘蟲微粒子的粘蟲F.感染粘蟲微粒子的中紅側溝繭蜂取上述A-F六種樣品用本發明所述的試劑盒制備DNA模板，并進行PCR反應，擴增產物進行電泳檢測，方法同實施例1。
結果從圖5可以看出，感染不同種的Nosema屬微粒子的家蠶、甜菜夜蛾、粘蟲、紅側溝繭蜂都可以通過本試劑盒檢測出來，說明本發明的方法在檢測Nosema屬微粒子病的應用中具有廣譜性。
權利要求
1.一種檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，它包括步驟(a)制備待測昆蟲樣品PCR反應模板昆蟲樣品放入DNA提取液中，搗碎混勻，加入DNA抽提液，離心，取上清液DNA模板；DNA提取液包括1-100mM的二價金屬離子螯合劑和0.1％-5％(W/V)的去垢劑，并且用堿性物質將提取液的pH值調至11-14；(b)用檢測16S小亞基rRNA基因的特異性引物和步驟(a)中模板，在特異性擴增條件下進行PCR擴增；(c)對步驟(b)的擴增產物進行電泳檢測，根據電泳結果判斷16S小亞基rRNA基因的存在與否。
2.按權利要求1所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，其特征在于，DNA提取液中的堿性物質為NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液。
3.按權利要求1所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，其特征在于，DNA抽提液為苯酚氯仿溶液。
4.按權利要求1所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，其特征在于，二價金屬離子螯合劑為EDTA或EGTA。
5.按權利要求1所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，其特征在于，去垢劑為SDS、Triton X-100或Tween 80。
6.按權利要求1所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，其特征在于，所用的16S小亞基rRNA基因的特異性引物為A引物或B引物所述的A引物包括引物15’GTT GAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；所述的B引物包括引物1’5’CCT GTA TGA TGA TCG ATG CAG3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。
7.按權利要求1所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的方法，其特征在于，電泳是在0.5％-2％濃度的瓊脂糖凝膠中電泳。
8.一種檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的試劑盒，該試劑盒包括(a)提取液試劑含有1-100mM的二價金屬離子螯合劑和0.1-5％(W/V)的去垢劑，并且用堿將提取液的pH值調至11-14；和(b)檢測16S小亞基rRNA基因的特異性引物及PCR擴增所需的試劑；
9.按權利要求8所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的試劑盒，其特征在于，提取液試劑中的堿性物質為NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3溶液。
10.按權利要求8所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的試劑盒，其特征在于，提取液試劑中的二價金屬離子螯合劑為EDTA或EGTA。
11.按權利要求8所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的試劑盒，其特征在于，提取液試劑中的去垢劑為SDS、Triton X-100或Tween 80。
12.按權利要求8所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的試劑盒，其特征在于，所用的16S小亞基rRNA基因的特異性引物為A引物或B引物所述的A引物包括引物15’GTT GAT TCT GCC TGA GGT AGA CGC T3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’；所述的B引物包括引物1’5’CCT GTA TGA TGA TCG ATG CAG3’，和引物25’CAA TGG TAT CTA ATC ACC TTC G 3’。
13.按權利要求8所述的檢測家蠶及其它昆蟲微粒子病的試劑盒，其特征在于，PCR擴增所需的試劑中加入滅菌的礦物油。
全文摘要
本發明涉及一種昆蟲微粒子病(Nosema屬)的診斷方法及其診斷試劑盒。具體地，本發明通過堿、二價金屬離子螯合劑與去垢劑組成的DNA提取液處理樣品，再經過苯酚氯仿抽提得到樣品中的DNA；并根據微粒子(Nosema屬)基因組中一段高度保守的DNA序列設計的引物來擴增微粒子基因組片段；通過電泳即可檢測出昆蟲是否受到微粒子(Nosema屬)感染。本發明的方法和相關的試劑盒具有成本低、使用簡便、特異性強、廣譜性高等優點，并能檢測出發病早期的感染昆蟲。
文檔編號G01N33/561GK1470872SQ02125360
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月26日 優先權日2002年7月26日
發明者秦啟聯, 宋憲軍, 苗麟, 李瑄, 任璐, 丁翠, 伍一軍 申請人:成都天友生物科技股份有限公司, 中國科學院動物研究所