一種全抗家蠶血液型膿病的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種育種方法，尤其涉及一種全抗家蠶血液型膿病的育種方法，屬于動(dòng)物育種技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶(Bombyx mori L.)屬鱗翅目、蠶蛾科。家蠶起源于我國(guó)，早在四、五千年前，我們祖先就栽桑養(yǎng)蠶，是舉世公認(rèn)的偉大發(fā)明之一。我國(guó)四川、浙江、江蘇、廣東的養(yǎng)蠶業(yè)最為發(fā)達(dá)，因病毒性疾病所造成的損失，約占總蠶病損失的70-80%，而家蠶核型多角體病毒(NPV)病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見(jiàn)的危害最嚴(yán)重的一類(lèi)蠶病，家蠶患此病的后期常流出膿汁，內(nèi)含大量的多角體病毒，俗稱(chēng)膿病。家蠶核型多角體病毒(Bombyx moriNucleopolyhedrovirus, BmNPV)，多角體的形狀不一，多數(shù)為四角形、六角形，多角體的大小范圍在0.5-15 μ之間，一般為2-6μπι。病毒粒子為桿狀，測(cè)定其大小為400X90nm。在病毒粒子的超微結(jié)構(gòu)中，最顯著的是在粒子一端具有乳頭狀突起，認(rèn)為是病毒感染細(xì)胞的吸附裝置。家蠶NPV的DNA含量約占病毒粒子的10%左右，在電鏡下觀察到此雙鏈DNA為松弛環(huán)狀分子和線(xiàn)形分子，有的線(xiàn)形分子的長(zhǎng)度可達(dá)10u_36u。并計(jì)算出家蠶NPV-DNA的分子量為75X 106d。我國(guó)各蠶區(qū)對(duì)家蠶膿病的防治采取了多種措施。①培育抗病性品種，因?yàn)樾Q的種間和品種間對(duì)病毒病的抵抗力差異較大，而且此種抵抗力具有遺傳性。②改善管理技術(shù)和飼料調(diào)劑，避免創(chuàng)傷感染，采用藥劑預(yù)防。③研究化學(xué)防治。現(xiàn)有培育抗病性品種的方法有下述2種:
[0003](I)、2齡經(jīng)口添食病毒法:2齡經(jīng)口添食一定濃度的核型多角體病毒于桑葉上喂食24小時(shí)，72小時(shí)后調(diào)查死亡率，用半致死濃度指標(biāo)調(diào)查抗病性。這種方法對(duì)抗性主基因的篩選固定有一定效果，但病毒濃度在15-1O9個(gè)/毫升仍然出現(xiàn)不同程度的死亡，對(duì)抗性微效基因篩選固定效果不明顯，同時(shí)抗性易退化，很難實(shí)用化。家蠶對(duì)血液型膿病的抗性在整個(gè)齡期都處于一種侵襲和防御過(guò)程，體液、圍食膜、血球細(xì)胞等對(duì)核型多角體病毒有抵抗和使病毒不活化作用。家蠶屬完全變態(tài)昆蟲(chóng)，而這種生理變化在同一蠶品種的不同時(shí)期抗性將表現(xiàn)為一致性或不一致性。同時(shí)，病毒在蛹期具有侵染卵巢細(xì)胞致使核型多角體病毒垂直傳遞下代的可能性，致使下代1-2少量死亡，4齡開(kāi)始爆發(fā)血液型膿病的可能性。現(xiàn)有方法選在2齡起蠶添食病毒，代表家蠶幼蟲(chóng)期的抗性水平。但家蠶在幼蟲(chóng)期根據(jù)發(fā)育快慢主要分2個(gè)時(shí)期:1-3齡為稚蠶期，發(fā)育較緩慢；4-5齡壯蠶期，生長(zhǎng)發(fā)育快速。2個(gè)時(shí)期的生理變化極大，造成抗病在稚蠶期與壯蠶期發(fā)生顯著變化。經(jīng)試驗(yàn)調(diào)查，2齡起蠶添食病毒全抗單蛾，繼續(xù)在4齡添食將發(fā)生不同程度的死亡，最大死亡率將超過(guò)50%以上，因此現(xiàn)有方法選在2齡起蠶添食病毒，只能代表在1-3齡稚蠶期抗病水平，不能代表家蠶整個(gè)幼蟲(chóng)期的抗性水平，更不能代表蛹期對(duì)病毒的抵御侵染，避免垂直傳遞的水平。用18個(gè)/毫升以上病毒濃度添食下篩選，這種方法能夠保證抗性主基因的導(dǎo)入與純合，在篩選過(guò)程中丟失了抗性微效基因，致使育成蠶品種在17個(gè)/毫升病毒濃度甚至更低濃度仍有5%左右的死亡率，難以培育出全抗血液型膿病蠶品種。
[0004](2)、利用生物工程的轉(zhuǎn)基因手段培育家蠶抗血液型膿病蠶品種，該技術(shù)繁瑣、耗時(shí)、耗物、實(shí)用性差，難以普及，未達(dá)到實(shí)用化。如申請(qǐng)?zhí)枮?00810024110.6，申請(qǐng)日為2008-04-30，名稱(chēng)為“對(duì)血液型膿病具有高抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶制作方法”的一篇中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)，利用轉(zhuǎn)基因的方法篩選家蠶品種轉(zhuǎn)入的是抗性主基因的功能區(qū)段，可以獲得高抗性個(gè)體，在群體中可以檢測(cè)到千分之幾的高抗個(gè)體，但是，高抗個(gè)體后代抗性難以固定，這是家蠶轉(zhuǎn)基因方法目前遇到的瓶頸。又由于家蠶對(duì)血液型膿病的抗性是由I個(gè)主基因和多個(gè)微效基因共同控制的性狀，因此轉(zhuǎn)基因方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)全抗性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種全抗家蠶血液型膿病的育種方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶核型多角體病毒的全抗性。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案解決技術(shù)問(wèn)題:一種全抗家蠶血液型膿病的育種方法，包括以下步驟:
[0007]第一步、將含有蠶核型多角體病毒的桑葉對(duì)蠶進(jìn)行喂食，篩選得到病毒存活率達(dá)到50%以上，檢測(cè)無(wú)多角體病毒的雌、雄蛾作為抗血液型膿病供體親本；
[0008]第二步、將抗性供體親本雄蛾與受體親本雌蛾野B(來(lái)源于江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所)雜交，得到含血液型膿病抗性基因的蠶種F1代，混合培育經(jīng)2齡、4齡起的蠶，連續(xù)添食家蠶核型多角體病毒，篩選出抗性個(gè)體繼代作為匕代；
[0009]第三步、對(duì)所述F2代的蠶種進(jìn)行單蛾育，重復(fù)第二步方法，將單蛾育存活率50%以上的蠶留種繼代作為F3代；
[0010]第四步、單蛾育50區(qū)，每個(gè)單蛾育區(qū)選擇50頭2齡起的蠶添食家蠶核型多角體病毒進(jìn)行篩選，將50頭全存活對(duì)應(yīng)的單蛾區(qū)4齡起蠶全部添食家蠶核型多角體病毒，進(jìn)行篩選，選留全存活的單蛾區(qū)留種繼代作為匕代；
[0011]第五步、每個(gè)系統(tǒng)飼養(yǎng)10個(gè)單蛾區(qū)，以8個(gè)系統(tǒng)為宜，2齡起蠶每個(gè)單蛾區(qū)直接添食家蠶核型多角體病毒篩選，選留全抗單蛾區(qū)超過(guò)50%的系統(tǒng)，將其中所有全抗單蛾一直飼養(yǎng)至上蔟結(jié)繭，留種繼代作為匕代；
[0012]第六步、每個(gè)系統(tǒng)飼養(yǎng)6個(gè)單蛾區(qū)，以8個(gè)系統(tǒng)為宜，2齡起蠶每個(gè)單蛾區(qū)直接添食家蠶核型多角體病毒篩選，調(diào)查選留全抗單蛾區(qū)100%的系統(tǒng)，將選出系統(tǒng)中的所有單蛾4齡起蠶繼續(xù)添食家蠶核型多角體病毒篩選，得到全抗品系為匕代；
[0013]第七步、在F6-F7R不添食家蠶核型多角體病毒，進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，在F8R，對(duì)2齡起蠶進(jìn)行全部單蛾區(qū)添食家蠶核型多角體病毒，將單蛾區(qū)3-5頭發(fā)病的系統(tǒng)淘汰，留下所有單蛾區(qū)100%無(wú)發(fā)病的系統(tǒng)，得到穩(wěn)定的全抗系統(tǒng)，即為全抗家蠶血液型膿病的蠶種。
[0014]在上述方法的第一步中，抗血液型膿病供體親本的篩選方法具體是:選擇江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所保存的強(qiáng)健性育種素材50份，每份28個(gè)單蛾混合收蟻2克，選擇2齡起蠶2000頭，將桑葉切成2厘米X 2厘米浸入含有家蠶核型多角體病毒的溶液，用蠶筷揀出已浸病毒的桑葉均勻添食，24小時(shí)后，添食正常桑葉飼養(yǎng)，3齡起蠶喂食2次桑葉后，將健康蠶用蠶筷揀出常規(guī)飼養(yǎng)，4齡起蠶將桑葉橫豎兩刀均勻切成4片，浸入含有家蠶核型多角體病毒的溶液，繼續(xù)用蠶筷揀出已浸病毒的桑葉均勻添食，24小時(shí)后，添食正常桑葉飼養(yǎng)，4齡眠中、5齡起蠶及5齡中期淘汰病蠶，上蔟結(jié)繭后，雌、雄蛾對(duì)號(hào)交配，產(chǎn)卵I周后，60-650C烘蛾5小時(shí)，檢測(cè)雌、雄蛾病毒多角體，將無(wú)病毒多角體的對(duì)應(yīng)蠶種繼代飼養(yǎng)，作為篩選出的抗性供體親本匕1;按抗性供體親本F M的篩選方法，對(duì)留選素材繼續(xù)混合篩選，得到抗性供體親本F。”再重復(fù)抗性供體親本Fm的篩選方法，得到抗性供體親本F。3，對(duì)2、4齡起蠶添食病毒存活率達(dá)到50%以上單蛾，雌、雄蛾檢測(cè)無(wú)病毒多角體的蠶種，作為抗血液型膿病基因供體親本。
[0015]所述含有家蠶多角體病毒的溶液濃度為18個(gè)/毫升，添食時(shí)間在2齡起蠶和4齡起蠶連續(xù)添食3次。18個(gè)/毫升病毒濃度在2齡、4齡添食50%存活結(jié)合雌、雄蛾多角體檢測(cè)，能夠保證1-3齡稚蠶期、4-5齡壯蠶期及蛹期抗性主基因均存在于供體親本中。所述第二步至第七步，家蠶多角體病毒濃度為17個(gè)/毫升，有利于抗性主基因和抗性微效多基因同時(shí)保留，是篩選到抗性主基因和微效多基因最有效濃度。在第七步獲得全抗家蠶血液型膿病的蠶種后，將單蛾育規(guī)模擴(kuò)大到60區(qū)以上，2齡起蠶添食家蠶多角體病毒濃度為17個(gè)/毫升，無(wú)I頭蠶發(fā)膿病，證明已篩選到抗性主基因和微效多基因。不同發(fā)育階段的抗性穩(wěn)定具體是用2齡、4齡連續(xù)添食病毒并結(jié)合雌、雄蛾檢測(cè)方法，將雌、雄對(duì)號(hào)交配制種裝盒后，在25°C下存放I周后，用60-65°C烘干5小時(shí)，顯微鏡調(diào)制放大倍數(shù)600倍檢測(cè)雌、雄蛾病毒多角體，將雌、雄蛾均未檢到多角體病毒的對(duì)應(yīng)蛾區(qū)留種繼代，培育出在1-3齡小蠶期、4-5齡大蠶期及蛹期不同發(fā)育階段抗性穩(wěn)定的蠶品種。
[0016]本發(fā)明的方法具有廣譜性，一般育種單位均可實(shí)施，我國(guó)家蠶品種保存資源豐富，共有1000多份，一般育種單位均保存著一定數(shù)量的蠶品種資源，抗性基因存在于強(qiáng)健性蠶品種資源中，不同蠶品種抗性表現(xiàn)不一，經(jīng)技術(shù)方案第一步方法一般育種單位能夠從中篩選獲得導(dǎo)入抗性基因親本素材。受體親本為需要改進(jìn)的現(xiàn)行育成蠶品種，我國(guó)通過(guò)審定的育成蠶品種有100多個(gè)，根據(jù)育種部門(mén)需要改進(jìn)的蠶品種不同而選擇。
[0017]本發(fā)明中，以一只雌蛾所產(chǎn)的蠶卵為一個(gè)群體，計(jì)量單位為蛾或蛾區(qū)。以蛾區(qū)為單位分別飼養(yǎng)，稱(chēng)為蛾區(qū)育，也稱(chēng)單蛾育。I個(gè)蛾區(qū)有400——500粒蠶卵，飼養(yǎng)后可獲得400多粒蠶繭。
[0018]本發(fā)明在育種早期世代用2齡、4齡連續(xù)添食含病毒的桑葉，添食病毒濃度的選擇是基于家蠶對(duì)血液型膿病的抗性規(guī)律設(shè)置。受體家蠶品種存在豐富的抗性微效基因，在2齡起蠶17個(gè)/毫升病毒濃度添食下一般仍有5%左右的存活率，這些存活蠶是抗性微效基因作用的結(jié)果，如果在2齡起蠶18個(gè)/毫升及以上病毒濃度添食常規(guī)蠶品種，幾乎無(wú)存活個(gè)體。因此，選用17個(gè)/毫升病毒濃度添食有利于抗性主基因和抗性微效基因的同時(shí)篩選獲得全抗性，并結(jié)合雌、雄蛾檢測(cè)病毒多角體，能夠快速聚合抗血液型膿病基因，獲得全抗單蛾及系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)育成蠶品種在1-3齡小蠶期、4-5齡大蠶期及蛹期的穩(wěn)定抗病性能。其有益效果是:不僅能夠獲得高抗性個(gè)體，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液型膿病抗性主基因篩選固定和微效基因的篩選固定，篩選到在稚蠶期、壯蠶期及蛹期不同發(fā)育階段抗性表現(xiàn)一致的抗性穩(wěn)定蠶品種，實(shí)現(xiàn)家蠶對(duì)血液型膿病的全抗性。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例
[0020]野三元蠶品種全抗血液型膿病培育，家蠶核型多角體病毒來(lái)源于江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所病理研究室，蠶品種來(lái)源于江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所育種研究室。按以下步驟進(jìn)行:
[0021]第一步、抗血液型膿病供體親本素材的篩選
[0022]1、抗性供體親本FOl添食病毒篩選
[0023]選擇江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所保存的強(qiáng)健性育種素材50份，每份28個(gè)單蛾混合收蟻2克，2齡起蠶2000頭，將桑葉切成2厘米X 2厘米浸入18個(gè)/毫升家蠶核型多角體病毒濃度的溶液，用蠶筷揀