專利名稱：Zstk474在制備治療自身免性疾病藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于老藥新用的技術領域，涉及2- (2- 二氟甲基苯并咪唑-1-基)_4，6- 二嗎啉基-1，3，5-三嗪GSTK474)在制備治療自身免性、炎癥性疾病藥物方面的應用。
背景技術：
樹突狀細胞(dendritic cells, DC)是已知的機體內功能最強的抗原提呈細胞 (antigen-presenting cells, APC),也是目前發現的唯一的能直接激活初始型T細胞的 APC[1]。發生炎癥時，DC最先與抗原接觸進而捕獲抗原，經加工處理后使抗原肽與MHC分子結合而提呈到其他免疫細胞表面，引起細胞因子分泌，在第一、第二信號共同作用下，激活T淋巴細胞，產生特異性的免疫應答反應；另一方面DC可分化調節性細胞，維持自身耐受，成為介導免疫應答與耐受的關鍵因素[2]。因此，APC是免疫反應的首要環節。一般認為，人體DC有不同的DC亞群存在。若根據其分化發育主要經歷的四個階段即分化程度，DC又可分為骨髓中起源于CD34+多能干細胞的遠祖細胞，外周血中的前體細胞，定居于外周組織中的未成熟DC(immature DC, iDC)，定居于次級淋巴組織中的成熟 DC (mature DC, mDC) [3]0鑒于DC前體細胞在不同分化階段，不同的微環境中，發揮著不同的生物學功能。Banchereau將DC的發育分為4個階段(1)骨髓中的祖細胞；(2)與病原體相互識別前在血液、淋巴管和淋巴組織中巡邏的DC前體，它們可分泌大量的細胞因子使炎癥局限化；(3)駐留組織的不成熟DC，它們擁有強大的吞噬功能便于抗原的攝取；(4) 成熟DC，出現于次級淋巴器官中，高表達協同刺激分子進行抗原的提呈[4]。因此，DC的分化和成熟的狀態決定了免疫反應的起始和精細平衡調節的結果。而免疫起始或者免疫平衡調節的異常是導致免疫和自身免疫疾病的主要原因。DC的成熟狀態決定免疫應答的結局。iDC就象體內的“衛兵”，起著免疫監視的作用，它分布于幾乎所有組織和器官，具有強大的內吞作用，持續地從外周組織攝取抗原遷移至局部次級淋巴組織，但其抗原提呈功能低下。在無感染和無組織損傷的正常生理狀態下， 存在于外周組織的iDC不斷地攝取自身抗原及非感染環境中的蛋白質(如呼吸道和消化道中的蛋白質)，進入引流淋巴結，誘導外周耐受[5]。“耐受性DC”可能通過如下機制誘導耐受(1)誘導T細胞的無能或低能反應。耐受性DC低水平表達MHC分子，幾乎不表達 ⑶40，⑶80，⑶86，IFA3, ICAM-I等激活T細胞所必須的第二信號分子；(2)誘導T細胞凋亡。抗原特異性T細胞TCR與表達!^asL的DC的MHC結合的同時，其Fas與DC表面!^asL 結合，介導這些T細胞凋亡[6]。( 誘導調節性T細胞產生。耐受性DC能夠促進初始T 細胞轉化為T-reg，反過來T-reg又可以誘導DC前體轉化為耐受性DCm。這種機制使得機體的免疫系統能夠更好地識別和防御炎癥和組織損傷時的“危險信號”(danger signal )，而對自身抗原和無害的外源性抗原保持耐受。DC是一把雙刃劍，既可誘導免疫耐受，也可刺激強烈的免疫應答，其成熟狀態在免疫平衡中起決定性作用。不成熟DC具有很強的捕獲抗原的能力，但是刺激T細胞的能力很低。只有在出現刺激性的信號(如IL-I β，TNF)或由細菌引起的刺激時，DC由不成熟階段轉向成熟DC，高表達細胞表面共刺激分子同時遷移到淋巴結誘導抗原特異性T細胞的增殖。活化了的T細胞又反過來通過CD 40為信號，釋放細胞因子刺激DC，誘導DC活化。 在多種疾病中，發現發病組織的DC經常處于一種不成熟的狀態，不能遷移到淋巴結[8]。在自身免疫疾病中，DC分化、激活、抗原識別或提呈等功能異常或過于活化，或者DC刺激的T 細胞功能異常或過度激活。因此導致免疫系統識別自身抗原進而攻擊自體細胞或組織而產生自身免疫疾病。化學名2-(2-二氟甲基苯并咪唑-1-基)_4，6-二嗎啉基-1，3，5-三嗪，(簡稱 ZSTK474)，它是一種新型的S -三嗪衍生物，是一個強有力的PII抑制劑，具有高選擇性。 曾經報道^511(474強烈地抑制腫瘤細胞的生長，在體外和體內具有抗腫瘤療效，與G 0 / G 1期阻滯和抗血管生成活性。MTK47已用于對人類癌癥移植以及給小鼠口服時具有強抗腫瘤活性° Furthermore, ZSTK474 did not show significant toxicity at the doses tested.此外，ZSTK474沒有表現出顯著的毒性測試的劑量。ZSTK474是一種新型特異的 PI3K靶向抑制藥物，其特異性抑制PUK信號通路，可在極低濃度下達到完全抑制的效果 (1 μ M的濃度可完全抑制)；專一性好，30 μ M時對130多種不同途徑的蛋白激酶無抑制效果，對細胞毒性低。ZSTK474最初被發現可以強烈抑制腫瘤細胞的生長，而且適合口服；在體內試驗抗腫瘤活性時，對注射人類腫瘤細胞的小鼠的主要器官沒有毒性[1-5]，目前已經進入臨床II期實驗，有望成為新型抗腫瘤藥物。PII抑制劑通過抑制PII/Akt通路對多種免疫細胞起作用。目前對PII信號傳導通路的研究多集中在PII/Akt通路方面。Akt是原癌基因c-akt表達編碼的絲/蘇氨基酸激酶，具有與多種蛋白激酶同源的PH結構域，是PUK直接的靶蛋白。PUK (磷脂酰肌醇-3激酶)是一個磷酸化磷酸肌醇的肌醇環上3-羥基基團的脂質激酶家族，是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子，可被多種細胞因子和理化因素激活，調節多種細胞功能，如凋亡、增殖、代謝、生長轉化、膜轉運、分泌和趨化等，并在炎癥、腫瘤、代謝和心血管疾病的發病機制中起重要作用。PII由調節亞基p85和催化亞基pllO構成的異二聚體。現在發現的調節亞基P85至少有5種異構體ρ85 α、ρ85 β、ρ55 γ、ρ50 α、ρ^ α (其中ρ50α、ρ55α是ρ85 α基因輪流剪切的編碼產物)；其序列具有高度同源性；氨基端有一 SH3區，羧基端有兩個SH2區，與受體pYXXM基序具有高親和力，中間編碼區與催化亞單位PllO結合。催化亞基pllO有4種異構體pi 10 α、pi 10 β、pi 10 γ和pi 10 δ,分別由不同基因編碼，均包含催化域、PIK結構域、C2結構域及Ras結合結構域。調節亞基和催化亞基存在多種異構體，具有組織特異性并可于不同受體結合，這與其參與多種細胞的多種功能相關。根據他們的結構特點和底物結合的特異性，被分成三類。I類ΡΙ3Κ主要磷酸化磷酸肌醇4，5 二磷酸(簡稱ΡΙΡ2)生成磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸肌醇(ΡΙΡ3)，ΡΙΡ3募集和磷酸化Akt的。因此，在細胞反應(如增殖)中發揮了重要的作用。通常PII指的是 I類ΡΙ3Κ，其它兩類PII的功能很少知道。I類PII有四個異構體，分別為α、β、δ禾口 ￥。1類？11(1在腫瘤發生中起重要作用，由于PIK3CA基因突變的高頻率，這個基因編碼的 PllOa已經在人類癌癥中發現。最近有報道說PII β在腫瘤抑制基因PTEN (phosphatase and tensin omology deleted on chromosome ten)的腫瘤發生中發揮重要作用。而PWK δ 和PII γ也被認為參與在各種炎癥反應和免疫系統Μ。本發明在于發現ΜΤΚ474抑制自身免疫和炎癥反應及其相關疾病上的應用。
DCs在先天和適應性免疫反應引發中起到重要的作用。雖然DCs的普遍作用是抗原提呈和T淋巴細胞的激活，DCs在分化的不同階段有不同的表面標志物、遷移模式以及細胞因子產量。這些不同決定了T細胞他們相互作用的命運。最初的T細胞激活依賴于T細胞受體的牽引和通過在APCs(例如DCs)表面上表達的⑶觀和⑶80/86共刺激信號。因此， 我們通過檢測DC細胞因子產量和表面標記物⑶80，⑶83，⑶86以及HLA-DR的表達來調查 ZSTK474是否影響DC分化和激活。我們也研究MTK474對未成熟DC的抗原攝取能力和成熟DC的T細胞增殖刺激活性。這項研究提供了 ZSTK474的生理功能和醫學應用的進一步理解。

發明內容
本發明的目的是公開一種2- -二氟甲基苯并咪唑-1-基)-4，6_ 二嗎啉基-1，3，5-三嗪在制備作為治療自身免疫性、炎癥性疾病藥物方面的應用。本發明所述的自身免疫性疾病指的是免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫性疾病。其中免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫疾病指的是多發性硬化癥、自身免疫性視網膜炎、視神經脊髓炎、系統性紅斑狼瘡、糖尿病、甲狀腺、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、潰傷性結腸炎、皮炎、肌炎、系統性硬化癥。本發明所述的炎癥性疾病指的神經系統炎癥性疾病。特別是多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎。免疫活性細胞如樹突狀細胞等具有識別外來抗原或者認為對生物體有害的自身抗原的機制。免疫細胞識別自身抗原而引起自身免疫反應是多種免疫疾病的發病基礎。例如多發性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)、視神經脊髓炎(neuromyelitis optica)、自身免疫性視網膜炎、系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)、糖尿病、甲狀腺、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、古德帕斯徹病(Goodpasturee’ s disease)、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis)、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、斯耶格倫綜合癥(Sjogren syndrome)、潰傷性結腸炎、皮炎、萊特爾綜合癥(Reiter syndrome)、肌炎(miositis)、系統性硬化癥等。而抑制免疫細胞，尤其是抑制免疫系統前沿的具有專業的抗原呈遞能力的樹突狀細胞的物質將具有潛在的治療自身免疫性疾病的用途。本發明所述的應用，其中自身免疫性疾病指的是上述所指的自身免疫疾病，尤其是中樞神經系統炎癥性疾病，例如人多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等等，典型的是人多發性硬化癥。多發性硬化癥是自身免疫性炎癥性疾病，特征是中樞神經系統功能障礙的癥狀和體征的多樣化，配合反復的緩解與復發.最常見的發病癥狀為感覺異常，出現在一個或幾個肢體，軀干或一側的面部；腿或手的無力或笨拙；或視覺障礙，例如單眼的部分性失明與眼球活動時的疼痛，視物模糊或暗點.其他常見的早期癥狀包括眼肌癱瘓造成的復視， 一個或多個肢體的短暫無力，輕微的步態障礙，一個肢體的輕度僵硬與異常的易疲乏，膀胱控制困難，眩暈，以及輕度的情緒障礙。自身免疫性炎癥特別指的是人多發性硬化癥、視神經脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎，通過抑制免疫樹突狀細胞的分化、成熟、抗原呈遞和T細胞增殖等細胞學實驗和小鼠疾病動物模型實驗證明可以治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性中樞神經系統炎癥性疾病。視神經脊髓炎最早認為是多發性硬化的一種，近些年隨著臨床診斷和病理研究的發展，才細分為自身免疫性視神經脊髓炎。急性播散性腦脊髓炎，又稱感染后腦脊髓炎、預防接種后腦脊髓炎，是指繼發于麻診、風疹、水痘、天花等急性出疹性疾病，或預防接種后，因免疫機能障礙引起中樞神經系統內的脫髓鞘疾病。^ ! g ^ ^iiSjii WfS ^(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是人多發性硬化癥(Multiple Sclerosis, MS)和急性播散性腦脊髓炎(Acute disseminated enc印halomyelitis，ADEM)等腦脊髓炎癥性疾病的動物模型，也是研究自身免疫性和炎癥性疾病的典型動物模型。是一種中樞神經系統自身免疫炎癥性脫髓鞘疾病。 其發病機理是由免疫細胞(輔助性T細胞THl和TH17細胞)介導的自身免疫性炎癥反應。 本發明以研究自身免疫性和炎癥性疾病的典型動物模型-小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎為例，發現MTK474可以有效減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎疾病的發生和發展。因此， 本發明在臨床上有望成為治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。本發明公開的MTK474化合物在治療自身免疫、炎癥性疾病藥物方面的應用，通常是以藥物組合物的形式服用的，可口服或非口服給藥，或者以和藥學上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物(如片劑、緩釋制劑、膠囊劑、注射劑、溶液劑)安全的口服或非口服給藥。當口服給藥時，組合物可配制成片劑、糖衣劑或膠囊。為制備口服藥物組合物可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤滑劑。例如，可通過壓制濕顆粒來制備片劑。活性成分與載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設備中進行顆粒化，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。本發明的系列化合物可以注射劑形式給藥，雖然劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變。實際服用的MTK474化合物的劑量應該由醫生根據有關的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態，選者的給藥途徑、年齡、體重、患者對藥物的個體反應，患者癥狀的嚴重程度等等。


圖1為ZSTK474抑制人樹突細胞的分化圖(流式細胞儀數據圖)； 圖2為ZSTK474抑制人樹突細胞的分化圖(對應流式細胞儀數據的柱狀圖)； 圖3為^1￥474抑制LPS激活的人樹突細胞的成熟圖(流式細胞儀數據圖)；它可以抑制免疫系統的激活，因此可以治療自身免疫性疾病；
圖4為ZSTK474抑制LPS激活的人樹突細胞的成熟圖(對應流式細胞儀數據的柱狀圖)；它可以抑制免疫系統的激活，因此可以治療自身免疫性疾病；
圖5為^1￥474抑制未成熟樹突細胞的抗原攝取能力圖；它可以抑制免疫系統的激活， 因此可以治療自身免疫性疾病；
圖6為ZSTK474抑制樹突細胞刺激的異體T細胞增殖反應(CFSE法)圖；它可以治療多發性硬化癥等T細胞介導的自身免疫性疾病；圖7為ZSTK474抑制樹突細胞介導的促進T輔助性細胞分化的細胞因子的分泌圖；它主要抑制炎癥性細胞因子的分泌，可能用于治療T細胞介導的炎癥性疾病； 圖8為ZSTK474減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病程度圖； 圖9為ZSTK474減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病臨床評分的總分數圖； 圖10為ZSTK474減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病臨床評分的最高分數圖。
具體實施例方式
下面結合實施例說明本發明，這里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定，其中2-(2-二氟甲基苯并咪唑-1-基)_4，6- 二嗎啉基-1，3，5-三嗪(ZSTK474)有市售，其它所用的試劑，除特別標注外均有市售。其中血液需經過衛生管理部門批準。實施例1
1. 1人外周血單核細胞的分離
(1)去血站取新鮮血液(經衛生管理部門批準)。大約為40 mL。(2)用3倍體積的PBS稀釋(稀釋的血樣越多，單核細胞的純化越好)。共160 mL 取15 mL的Ficoll Paque加入50 mL的離心管，離心管傾斜45°，吸取35 mL稀釋的血液， 在分離液面1 cm處沿管壁疊加在分離液上，勿破壞分離界面。(分4管，先在每管15 mL的 Ficoll Paque中加入35 mL血液，再平均剩余的血液)
(3)室溫400g離心30 min,緩慢減速，不可設置剎車檔，。(4)平穩取出離心管，最下層是紅細胞和粒細胞，中間層是淋巴細胞分離液，最上層是血漿和稀釋液等。血漿層和分離液交界處為易渾濁到灰白層(白膜)，吸出上層，留下單核細胞細胞層(一層白膜)，分布在相面上。(5)仔細轉移白膜(淋巴細胞、單核細胞、血小板)到新的50mL離心管。轉移至兩管。(6)在離心管中加入3倍體積的PBS，混合，室溫300g離心10 min。小心完全除去上清液。(7)為了除去血小板，在50 mL的緩沖液中重懸細胞沉淀，室溫下200g離心15 min,小心完全除去上清液。在200g離心時，血小板大部分停留在上清液中。(8)加入3倍體積的PBS混勻后計數。(9)再重復洗1次。注外周血單核細胞可能貯存于5%的BSA或血清和抗凝劑(肝素、EDTA或檸檬酸磷酸葡萄糖)中過夜。細胞在冰箱中貯存不超過一天。1. 2人類⑶14+單核細胞的純化
(1)取80μ 的細胞懸浮液與20 μ 的⑶14+微珠混勻后4°C孵育15 min，中間要混合一次(細胞與微珠按4:1加入)。(所有血細胞加300 μ 磁珠，再加1200 μ 含0. 5%BSA的 PBS)
(2)用20倍體積(2mL)預冷的PBS(含0. 5%BSA) 200g離心5 min洗滌一次，棄上清， 加入500 μ 的PBS。(3)離心期間，將MACS分離磁鐵安裝在MACS多用支架上，并將MS分選柱放在磁體
7中，分選柱下放一支干凈的無菌離心管。用遇冷的MACS緩沖液沖洗分選柱3次，每次0. 5mL。 棄洗脫液，再在分選柱下置一支干凈的無菌離心管，將細胞懸液上樣到分選柱上。(4)用MACS緩沖液沖洗分離柱，每次0. 5mL,洗3次(第一個0. 5mL慢加入以免擾動分選柱中的細胞)。(5)待細胞懸液全通過柱后，從磁體上取下分選柱，放在一個無菌15mL心管上。 在分選柱中加入ImL全RPMI1640培養基，將活塞塞入分離柱并洗脫CD14+單核細胞，計數。 將CD14—細胞凍存用于T細胞增殖實驗。(6) 流式細胞分選儀確認純度(95%)
(7)用含有 1000U/mL GM-CSF, 1000U/mL IL-4 的完全 RPMI1640 培養基(含 IOmM 的丙酮酸鈉，10 mM的谷氨酰胺，lOOPg/mL那霉素)調整細胞濃度為IXlO6個/mL并加入藥物。將細胞懸浮液2 mL/孔接種于十二孔板。1.3. ZSTK474處理時間和濃度確定
將得到的DC分成三組，每組進行了不同濃度的處理
第一組(分化)第一天加藥，第五天進行流式細胞術檢測。ZSTK474處理不同的濃度 ①正常對照組；②0. 008 μΜ/L ZSTK474處理五天組；③0. 04 μΜ/L ZSTK474處理五天組；
@ 0. 2 μΜ/L ZSTK474 處理五天組。第二組(分化)第五天加藥，第七天進行流式細胞術檢測。ZSTK474處理不同的濃度①正常對照組；②0. 02 μΜ/L ZSTK474處理兩天組；③0. 04 μΜ/L ZSTK474處理兩天組；
⑨0. 2 μΜ/L ZSTK474處理兩天組。
第三組(成熟)第五天加藥以及LPS (1 Pg/ml)，第七天進行流式細胞術檢測。 ZSTK474處理不同的濃度①陰性對照組(ZSTK474和LPS都不加);②對照組(只加LPS);
0. 02 μΜ/L ZSYK474+LPS 處理兩天組；⑨ 0. 04 μΜ/L ZSTK474+LPS 處理兩天組；⑤ 0. 2 μΜ/ L MTK474+LPS處理兩天組。在培養的第三天，吸取50%的上清，加入等量的含有1000 U/ml的GM-CSF，1000 U/ ml的IL-4的RPMI1640培養基并加入藥(按2 ml加)。注在第五天，在未加藥的孔中分別加入LPS及藥物，并在含有等量的1000 U/mL的GM-CSF，1000 U/mL的IL-4的RPMI1640 培養基中繼續培養兩天。1. 4流式分析
(1)在細胞分化成熟的第五天、第七天末收集細胞至1.5mL離心管，兩管，2000r離心 lOmin，再轉移上清至1. 5mL離心管，保留上清；
(2)用含有2mLPBS洗滌細胞，按照每IO5 cell/2 μ 的量加入DC表面標記抗體⑶80， CD86, CD83, HLA-DR，4°C下避光孵育 30min ；
(3)棄去染料，用2mL PBS洗滌細胞一次；
8(4)用2mL PBS重懸細胞，再加入ImL洲的多聚甲醛固定，300目濾網過濾，流式分析(5)用流式細胞儀進行檢測。FACS數據用CELLQuest軟件分析。1. 5 FITC-dextran 攝取檢測
收集第五天的分化未成熟細胞按IO5 cells/ml懸于RPMI1640完全培養基中，再加入 FITC-dextran (0. lmg/mL), 37°C培養箱孵育 30 min, 1000 r/min 離心 10 min，收集細胞， 用PBS清洗2次，最后重懸于流式管，分別檢測細胞的熒光強度，以4°C條件為基準，判斷細胞的抗原攝取能力。1. 6 ZSTK474抑制成熟DC引起的異體T細胞增殖
利用⑶4+磁珠分選異體⑶4+細胞，PBS洗兩遍，370C標記CFSE(羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂)染料10 min,2X105 cell/20(^l植于圓底96孔板，再按1 10、1 20、 1 40 (DC/⑶4+)加入絲裂霉素C和^1￥474處理過的成熟DC，共同培養4天后，收集細胞，做流式分析，以CFSE熒光強度的衰減次數顯示細胞增殖變化，見圖4。1. 7 ZSTK474抑制成熟DC產生促進Thl和Thl7分化的細胞因子
為了研究不同濃度的ZSTK474對成熟DC產生細胞因子的影響，我們在DC分化到第6 天時，加入不同濃度(0. 02μΜ/1，0· 04 μΜ/L，。· 2μΜ/1)的ZSTK474預處理3h，然后用IOOng/ ml的LPS刺激其成熟，分別于LPS加入的Oh、lh、2h、4h、8h、16h收集細胞，熒光定量PCR檢測 IL-12p;35、IL-12/23p40、IL-23pl9、IL-6、TNF-a , IFN- y 基因的表達見圖 5。1. 8 EAE小鼠模型的構建方法
小鼠EAE的誘導實驗方法8-10周大的性別、年齡和體重相同的雌性 C57BL/6野生型小鼠用來分組誘導EAE，每組n=12只小鼠。100 μ g M0G35-55多肽 (MEVGffYRSPFSRVVHLYRNGK)和 500 μ g 滅活的分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis) 與100 μ 1生理鹽水和100 μ 1 Freund' s佐劑完全混合，乳化，小鼠后背皮下分四個點注射(50 μΙ/點)。同時在當天和免疫48小時后每只小鼠分別腹腔注射200ng百日咳毒素 (pertussis toxin)。給藥組從第1天開始每天每公斤體重灌胃50mg的MTK474。9-14天后小鼠開始發生EAE。每天檢查記錄疾病臨床神經功能分級。小鼠EAE動物模型神經功能評分具體標準如下
0分，無明顯異常；0. 5分，部分尾巴無力松弛；1分，完全尾巴癱瘓；2分，后肢無力，行動遲緩，輕度共濟失調；2. 5分，一條后肢癱瘓；3分，兩條后肢癱瘓；3. 5分，后肢癱瘓，前肢無力；4分，前肢癱瘓；5分，瀕臨死亡。小鼠在9-14天時發生EAE，每天檢查并記錄疾病臨床神經功能分級。上述1. 1-1. 8的實驗結果說明
(1)通過抑制免疫樹突狀細胞的分化、成熟和抗原呈遞進而抑制免疫系統的起始和激活。(2)通過抑制免疫樹突狀細胞介導的T細胞增殖，進而抑制T細胞介導的相關疾病。(3)通過抑制免疫樹突狀細胞炎癥性細胞因子以及促進THl和TH17細胞分化的細胞因子的分泌，進而抑制炎癥相關疾病。(4)通過抑制小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的疾病臨床評分、總評分和疾病最高評分說明，有望治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等疾病。(5)綜合以上結果，可以治理多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病。參考文獻范凡1(綜述)，朱正秋2(審校).樹突狀細胞在腫瘤免疫治療中的應用進展.Medical Recapitulat Feb 2011 Vol 17，No. 4 文章編號 1006-2084(2011)04-0542-03.SteinmanRM, HeawigerD, NussenzweigMC. Tolerogenic dendritic cells [J], Annu Rev Immuno, 1 2003，21 (12): 685-711.Tjoa BA, Murphy GP. Progress in active specific immunotherapy of prostate cancer[ J]. Semin Surg Oncol, 2000, 18(1):80-97Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells[J], Annu Rev Immunol, 2000, 18:767-811Steinman RM, Hawiger D,Liu K, et al. Dendritic cell function in vivo during the steady state:a role in peripheral tolerance[J]. Ann NY Acad Sci , 2003 ,987:15-24Min W, Huang X, Gorezynski R, et al. Fas ligand-transfected dendritic cells induce apoptosis of antigen-specific T cells [J]. Transplant Proc, 2001，33(1-2):234-241Min MP, Zhou D, Ichim TE, et al. Inhibitory feedback loop between tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells in transplant tolerance[J]. J Immunol, 2003, 170:1304-1312Lespagnard L, Gancberg D, Rouas G, et al. Tumorinfiltrating den-dritic cells in adenocarcinomas of the breast : a study of 143neoplasmswith a correlation to usual prognostic factors and to clinical outcome[J] Int J Cancer ， 1999 , 84(3) :309-314
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權利要求
1.2- (2- 二氟甲基苯并咪唑-1-基)_4，6- 二嗎啉基-1，3，5-三嗪在制備作為治療自身免疫性、炎癥性疾病藥物方面的應用。
2.權利要求1所述的應用，其中所述的自身免疫性疾病指的是免疫樹突狀細胞或T 細胞相關的自身免疫性疾病。
3.權利要求2所述的應用，其中免疫樹突狀細胞或T細胞相關的自身免疫疾病指的是 多發性硬化癥、自身免疫性視網膜炎、視神經脊髓炎、系統性紅斑狼瘡、糖尿病、甲狀腺、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、潰傷性結腸炎、皮炎、肌炎、系統性硬化癥。
4.權利要求1所述的應用，其中炎癥性疾病指的神經系統炎癥性疾病。
5.權利要求4所述的應用，其中神經系統炎癥性疾病指的是多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎。
全文摘要
本發明公開了2-(2-二氟甲基苯并咪唑-1-基)-4,6-二嗎啉基-1,3,5-三嗪(簡稱ZSTK474)在制備作為治療自身免疫、炎癥性疾病藥物方面的應用。本發明的實驗結果表明ZSTK474可以抑制人免疫樹突狀細胞的分化，抑制LPS激活的人免疫樹突狀細胞的成熟度；可以抑制未成熟樹突細胞的抗原攝取能力和成熟樹突狀細胞的抗原提呈能力，可以抑制樹突細胞刺激的T細胞增殖反應。特別是ZSTK474可以減輕小鼠實驗性自身免疫腦脊髓炎的發病程度。因此，本發明有望在臨床上成為治療多發性硬化癥和急性播散性腦脊髓炎等自身免疫性炎癥性疾病的藥物。
文檔編號A61P27/02GK102429911SQ20111040390
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者張榮信, 薛振毅 申請人:天津醫科大學