專利名稱：特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物科學和診斷試劑領域，特別涉及特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其作為診斷和治療試劑的應用。
背景技術：
B-Raf 蛋白(也稱為 v-raf murine sarcoma viral oncogene homo log BI)是Raf/MiI絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一。該蛋白在調控細胞增殖的Ras/Raf/MEK/ERK/MAP級聯信號通路中期重要作用。B-Raf蛋白的突變在多種人類癌癥，例如黑色素癌、甲狀腺乳頭狀癌、直腸癌、卵巢癌中都存在(Garnett and Marais，Cancer Cell,6:313-319(2004))。這些突變導致B-Raf蛋白的持續激活，進而促進細胞的增殖轉化和癌細胞生長。V600E突變蛋白(第600位的纈氨酸(Valine，V)突變為谷氨酸(GlutamicAcid,E)的突變蛋白)在黑色素癌和甲狀腺乳頭狀癌中存在十分普遍(Capper et al., ActaNeuropathol，122 (I): 11-19 (2011))。其他的 B-Raf 突變包括 N581S 和 V600K 等。針對V600E突變蛋白的抑制劑正在研發中(Chapman et al., N Eng JMed, 364(26):2507-2516(2011))。在這種抑制劑的使用過程中，需要一種能夠特異性結合突變的B-Raf蛋白但是不結合野生型B-Raf蛋白的抗體。這種抗體可以被用來快速檢測少量的取自病人的樣品，用于診斷癌癥。能夠特異性結合B-Raf突變蛋白的抗體也是治療癌癥所迫切需要的。發明簡介本發明的目的是為解決上述問題而提供了分別特異性地識別B-Raf N581S,B-RafV600E和B-Raf V600K突 變體蛋白的三種單克隆抗體、制備方法及其應用。利用本發明的方法制備出的單克隆抗體能夠分別特異性地識別B-Raf N581S, B-Raf V600E和B-RafV600K突變體蛋白，而不識別野生型B-Raf蛋白。在一些操作實例中，所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結合部位，其特征在于，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列分別是由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285,CCTCC C2012122 以及 CCTCC C2012112 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列決定。在進一步的操作實例中，所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結合部位，其特征在于，由分別包含所述雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區域的氨基酸序列的一條重鏈和一條輕鏈組成。在更進一步的操作實例中，抗體或者抗原結合部位包含上述雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列。本發明的單克隆抗體可以是一種人源化的或者嵌合型的抗體。在某些操作實例中，這種單克隆抗體是IgG。在一方面，本發明包括保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122 以及 CCTCC C2012112 的雜交瘤細胞。CCTCC C201283的分類命名為:雜交瘤細胞株M43#-l，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCC C201284的分類命名為:雜交瘤細胞株M43#_2，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCC C201285的分類命名為:雜交瘤細胞株M43-3，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCC C201283的分類命名為:雜交瘤細胞株M43#_l，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCCC2012122的分類命名為:雜交瘤細胞株M60-28，保藏日期為:2012年8月24日；CCTCCC2012112的分類命名為:雜交瘤細胞株M73-48，保藏日期為:2012年8月24日.
本發明包括一種含有所述單克隆抗體或者抗原結合部位的藥物或者可用于藥物的載體。本發明還包括一種含有本發明中提到的單克隆抗體或者其抗原結合部位診斷試劑盒。在一些應用實例中，本發明能夠提供一種癌癥診斷的方法(例如，黑色素癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食道癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌)，其主要步驟包括:用本發明所述的單克隆抗體接觸來自于檢測目標的生物學樣本；檢測抗體或者其部分與樣本是否結合；如果抗體與樣本存在結合則表明被檢測對象是癌癥，或者存在發展成癌癥的風險。在另外的應用實例中，本發明提供一種治療腫瘤病人的方法，包括:檢測V600E、N581S或者V600K突變形式的B-Raf蛋白是否存在于來自于病人的樣本中；如果其中一個突變存在，則使用一種B-Raf抑制劑(例如GDC-0879)進行治療。本發明還提供一種治療癌癥病人(例如，黑色素癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食道癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌病人)的方法。該治療方法包括給予病人一種組成成分中含有本發明的單克隆抗體或者其抗原結合部分的藥物。本發明進一步提供一種使用本發明所述單克隆抗體或者其抗原結合部位作為藥劑治療黑色素癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食道癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌。本發明包括一種純化的核酸分子，其組成為能夠編碼本發明中的特異性結合突變B-Raf蛋白的的單克隆抗體 的重鏈或者輕鏈或者抗原結合部分的核酸序列。進一步本發明包括含有該核酸序列的載體；該載體優化為含有包括可以聯系到該核酸分子的表達調控序列。在一種應用實例中，本發明提供一種含有該核酸分子的宿主細胞。在另一個應用實例中，本發明提供一種能夠產生所述的單克隆抗體或者抗原結合部位的細胞株。本發明還包括一種生產特異性結合突變型而不結合野生型B-Raf蛋白的單克隆抗體或者抗原結合部位的方法。其步驟包括:在適當的條件下培養宿主細胞或者本發明中提到的細胞株；純化所述的抗體。本發明基于單克隆抗體特異性結合突變型的B-Raf蛋白的發現。我們發現這些抗體能夠非常好地優先結合突變的B-Raf蛋白(例如帶有N581S、V600E或者V600K突變的B-Raf蛋白)。這些抗體能夠有效地診斷或者治療癌癥等疾病。這些抗體特別能夠有效地檢測生物樣品中微量的B-Raf蛋白。B-Raf本專利所描述的B-Raf是指鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體BI (v-rafmurine sarcoma viral oncogene homolog BI, B-RAF)的基因或者蛋白(Sithanandam etal.，Oncogene，5 (12):1775-1780 (1990))。該基因或者蛋白也被稱為 B-Raf，BRAF, RAFBI,p94，NS7或者B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p94)。野生型的B-Raf蛋白序列包括SEQID NO:4，野生型B-Raf蛋白的編碼mRNA序列包括SEQ ID NO: 5。B-Raf是ral/mil家族的的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。B-Raf蛋白參與調控RAS/RAF/MEK/ERK/MAP級聯信號通路。B-Raf蛋白的突變型式包括的一個或者多個氨基酸的插入、刪除、替換等。本專利所描述的B-Raf N581S突變指的是第581位的天冬氨酸(N)被絲氨酸(S)替換的突變；B-RafV600E指的是第600位的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替換的突變；B_Raf V600K指的是第600位的纈氨酸(V)被賴氨酸(K)替換的突變。抗體與抗原結合部位本發明包括特異性結合突變型B-Raf蛋白但是不結合野生型B-Raf蛋白的單克隆抗體。“抗體”或者“免疫求蛋白Ig”指的是由重鏈(H，大約50-70kDa)和輕鏈(L，大約25kDa)通過二硫鍵鏈接成的四聚體。輕鏈可以是λ輕鏈或者K輕鏈。重鏈可以分為μ、δ、Υ、α、ε，不同重鏈和輕鏈的組合共同決定抗體的類型分別是IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE (Fundamental Immunology Ch.7, Paul, ff., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))。每條重鏈(有時稱為H鏈，或者HC)都含有一個重鏈可變區(也叫Vh)和一個重鏈恒定區(也叫CH)。重 鏈恒定區由三個結構與組成，分別每條輕鏈(有時也成為L鏈，或者LC)也有一個輕鏈可變區(也叫 ')和輕鏈恒定區(CJ。輕鏈恒定區只含有一個結構與Q，在輕鏈和重鏈內部，可變區和恒定區通過一個大約12個氨基酸左右的“J”形狀的結構鏈接起來。在重鏈內部還有一個3個氨基酸左右的“D”形區域。重鏈可變區和輕鏈可變區可以進一步被分為超可變區，也叫互補決定區(CDR)以及穿插中間的略微保守的框架區域(FR )。這些區域以此從N端往C端排列為FR 1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個結構區域的氨基酸序列排序是根據 Kabat(Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD(1987and 1991))和 Chothia&Lesk(Chothia&Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ;Chothia et al., Nature 342:878-883(1989))的研究結果分類的。本發明的內容之一是特異性結合突變型B-Raf蛋白的的單克隆抗體的抗原結合部位。“抗原結合部位”是指抗體上使其具有特異性識別并結合抗原(例如B-Raf蛋白上一段含有特定突變的多肽片段)的功能的一段抗體片段。目前認為，抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的部分片段來實現。抗體的“抗原結合部位”的特征在于包含:(I) 一個Fab片段，一個包含'、Vh、Q、Ch1結構域的單價片段；(2)—個F(ab’)2片段，一個含有通過鉸鏈區的的二硫鍵連接起來的Fab片段的二價片段；(3) —個包含Vh和ChI結構域的Fd片段；
(4)抗體單臂包含一個Vi^Vh結構域的Fv片段；(5)—個由Vh結構域組成的dAb片段(Wardet al., (1989)Nature 341:544-546) ； (6) 一個獨立的互補決定區(⑶R)。更進一步地，盡管Fv片段的兩個結構域Vh和\是由不同的獨立基因編碼的，但是可以用基因重組的方式通過合成一個鏈接區域將它們連接起來，形成由單鏈蛋白內部的Vh和\配對成單價分子，也稱為單鏈 Fv (scFv) (Bird et al.Science 242:423-426 (1988) and Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883(1988))。這種單鏈抗體也包括在“抗原結合部位”的范圍內。抗體的一部分，比如Fab和F(ab’)2片段，可以從全長的抗體通過常規的技術，比如木瓜酶(papain)或者胃蛋白酶(P印sin)酶消化的方法獲得。它們也可以通過下面描述的標準的DNA重組技術獲得。抗B-Raf抗體及其抗原結合部位本發明的抗體可以用來自于人類B-Raf突變蛋白的抗原免疫非人類的動物(例如，小鼠、兔子、大鼠或者倉鼠)來制備。這些抗體也可以通過噬菌體展示技術或者其它的已知的抗體制備技術獲得。抗原可以是純化的多聚多肽或者多肽，也可以是在細胞內表達的多聚多肽或者多肽。特定疾病相關的突變的B-Raf蛋白包括B-Raf V600E,B-Raf N581S，B-Raf V600K。本發明中特異性結合B-Raf V600E蛋白的抗體可以通過多肽KI⑶FGLATEKSRWSGS (SEQIDN0:1)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C201283, CCTCCC201284和CCTCC C201285。本發明中特異性結合B-Raf V600K蛋白的抗體可以通過多肽KI⑶FGLATKKSRWSGS (SEQ ID NO: 2)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C2012122。本發明中特異性結合B-Raf N581S蛋白的抗體可以通過多肽SIIHRDLKSNSIFLHED(SEQ ID NO:3)免疫小鼠來獲得。本發明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細胞已經保藏在符合布達佩斯協議的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCC2012112。本發明進一步包含一種單克隆抗體或者其抗原結合部位，它們包括由保藏號為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112 的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列。在一些操作實例中，本發明中的單克隆抗體或許只包含由保藏號為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCCC201285,CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列或者輕鏈氨基酸序列。在某些操作實例中，本發明的抗B-Raf抗體或者抗原結合部位包含一條或者多條由保藏號為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCCC2012112的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈或者CDR的氨基酸序列。在某些操作實例中，抗體或者抗原結合部位包括由保藏號為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285,CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的所有CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列。在某些操作實例中，本發明的抗B-Raf抗體或者抗原結合部位包含由保藏號為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112 的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區的氨基酸序列。在特定的操作實例中，抗體或者抗原結合部位同時包含由保藏號為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCCC201285、CCTCCC2012122、CCTCC C2012112的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區的氨基酸序列。B-Raf的結合特異性
本發明的抗體或者抗原結合部位能夠分別特異性地結合突變型的B-Raf V600E、B-Raf V600K、B-Raf N581S蛋白，但是不結合野生型的B-Raf蛋白(完全不結合或者在某種程度上不結合)。換言之，該抗體或者抗原結合部位能夠區分突變型和野生型的人類B-Raf蛋白。該結合的特異性可以用已知的常用檢測手段進行確認，例如免疫印跡實驗(Westernblot),酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，流式細胞分選，免疫共沉淀，免疫熒光，免疫組織化學染色，表面離子共振(例如BIAC0RE )或者放射免疫實驗等方法。在一些操作實例中，該抗體能夠特異性地優先結合突變型的B-Raf蛋白，對于突變型B-Raf蛋白的結合能力至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強于其對野生型B-Raf蛋白的結合能力。在某些操作實例中，本發明中的抗體或者抗原結合部位特異性結合突變型B-Raf蛋白的解離平衡常數Kd至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍強于對野生型B-Raf蛋白的結合的解離平衡常數(KD)。解離平衡常數(Kd)可以通過表面離子共振或者流式細胞計數測得。本發明的抗體或者抗原結合部位或許只能結合一種B-Raf突變蛋白而不能結合其他的B-Raf突變蛋白(例如B-Raf V600E,B-Raf V600K,B-Raf N581S中的一種)。舉例來說，該抗體特異性地結合B-Raf V600K蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強于其對其它任何一種突變B-Raf蛋白的結合能力。在一些操作實例中，該抗體或許只能結合B-Raf V600K蛋白而不結合其他突變型的B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf N581S蛋白)。舉例來說，該抗體特異性地結合B-Raf V600K蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強于其對其它任何一種突變B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf N581S蛋白)的結合能力。在另一些操作實例中，該抗體或許只能結合B-Raf N581S蛋白而不結合其他突變型的B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf V600K蛋白)。舉例來說，該抗體特異性地結合B-Raf N581S蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強于其對其它任何一種突變B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf V600K蛋白)的結合能力。在一些操作實例中，本發明中的抗體或者抗原結合部位能夠特異性結合含有SEQID NO: 1，2，或者3的B-Raf多肽。在一些操作實例中，本發明的抗體或者抗原結合部位特異性結合保藏號為 CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285, CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的抗原表位或者與其重合的抗原表位。生產抗體的重組方法本發明包括編碼能夠特異性結合人類突變型的B-Raf蛋白但是不能結合野生型B-Raf蛋白的單克隆抗體及其抗原結合部位的核酸序列。人類突變的B-Raf蛋白包括:V600E, V600K以及N581S。在一些操作實例當中，該核酸分子只編碼單克隆抗體或者抗原結合部位的重鏈或者輕鏈。在另外一些操作實例當中，該核酸分子同時編碼單克隆抗體及其抗原結合部位的重鏈和輕鏈。在一些操作實例中，該核酸分子編碼保藏號為CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285, CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112 的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈、輕鏈、重鏈可變區或者輕鏈可變區。核算可以是純化的核酸分子。 編碼本發明抗體的核酸分子可以從任何能夠產生該抗體的來源中獲得。例如，核酸可以從保藏號為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285,CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的雜交瘤細胞中獲得。分離純化編碼抗體的核酸的方法是一種已知的常見的技術。具體方法可以參見書籍:[美]J.莎姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，第三版，2002年。在一些操作實例中，編碼本發明中的單克隆抗體的重鏈的核酸序列可以是由編碼本發明抗體的Vh結構域的核酸序列與一條編碼任意其它來源抗體的重鏈恒定區的組成的同框編碼序列。類似地，一條編碼本發明的抗B-Raf蛋白的輕鏈的核酸分子也可以是由編碼本發明抗體的 ' 結構域的核酸序列與一條編碼任意其它來源的抗體的輕鏈恒定區的組成的同框編碼序列。在進一步的操作實例中，編碼重鏈可變區(Vh)和/或者輕鏈可變區(')的核酸分子被轉化為全長的抗體編碼基因。在一些操作實例中，編碼Vh或者\結構域的核酸序列被分別通過插入到已經含有重鏈恒定區(Ch)或者輕鏈恒定區(CJ的表達載體中去的方法構建為一個全長抗體基因。這樣構建的全長抗體基因的Ch的片段與Q的片段在載體內部相連接，并且/或者編碼Vh的片段與編碼\的片段在載體內部相連接。在另外的操作實例中，編碼Vh以及/或者\結構域的核酸序列分別通過核酸重組技術被連接到一個編碼Ch的片段和/或者編碼Q 的片段上面。編碼人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結構域的基因是已知的。具體參見著作 Kabat et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed., NIH Publ.N0.91-3242，1991。編碼全長重鏈和/或者輕鏈的核酸分子可以在被引入和純化B-Raf抗體的細胞株中表達。可以使用核酸分子實現重組表達大量的B-Raf抗體。也可以用核酸分子來生產嵌合抗體，雙特異性結合抗體，單鏈抗體，免疫粘附劑，雙頭抗體，突變抗體以及抗體衍生物。如果該核酸分子來自于非人類、非轉基因動物，該核酸分子也可能被用來實現抗體的人源化。本發明還包括插入有編碼抗體重鏈、輕鏈或者同時編碼本發明的B-Raf抗體或者其抗原結合部位的核酸分子。該載體可能適合于在原核宿主細胞,例如酵母細胞、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞中表達本發明中的抗體或者其抗原結合部位。常見的哺乳動物細胞包括很多永生細胞系都可以用來作為表達宿主。這些細胞系包括但不限于:中國倉鼠卵巢細胞(CH0)，NSO細胞，SP2細胞，HEK293T細胞，293Freestyle(Invitrogen公司)，NIH3T3細胞，HeLa細胞，幼倉鼠腎細胞(BHK)，非洲綠猴腎細胞，人類肝癌細胞(如IfepG2)，以及A549細胞。其它可以用于表達的細胞有昆蟲細胞，包括sf9和sf21細胞。植物宿主細胞包括:煙草，擬南芥，浮萍，玉米，小麥，番茄，水稻來源的細胞。細菌宿主細胞包括大腸桿菌和放線菌。酵母宿主包括裂殖酵母，釀酒酵母，畢赤酵母。利用不同的細胞系在不同的培養條件下，或者利用轉基因動物表達的抗體能夠有不同的糖基化模式。但是不論其糖基化模式是怎樣的，所有由所述的核酸或者含有所述核酸的序列編碼的抗體都是本發明的內容。嵌合與人源化抗體這里所說的嵌合抗體，其特征在于有來自于兩種或者更多種不同的抗體的結構域組成的抗體。例如，嵌合抗體的可變區結構域可能是來自于保藏號為CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285, CCTCC C2012122，或者 CCTCC C2012112 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體，但是其恒定區可能是來自于人類抗體。這種嵌合抗體在作為人類的治療藥物時具有較少的免疫原性。在一些操作實例中，本發明抗體的人源化抗體是一種將本發明中的來源于老鼠的抗體的CDR結構域插入到人類受體抗體中去。因此，嵌合抗體的FR和恒定區域來自于人類。這種含有人類FR區域的人源化B-Raf抗體在人類身上比只是恒定區來自于人類的嵌合抗體具有更小的免疫原性。在一些操作實例中，人源化抗體的CDR序列可以是來自于保藏號為 CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者 CCTCCC2012112 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體。抗體人源化的方法是一種已知的成熟技術。修飾與標簽抗體本發明還包 括以上所描述的抗B-Raf單克隆抗體或其抗原結合部位被至少一種額外分子或集團修飾而成的抗體。該修飾可以是用于純化或者檢測該抗體的，以及/或者增強其治療效果。例如，抗體或者抗原結合部位可以連接到一種檢測試劑、標簽、細胞毒性試劑、藥物分子以及/或者蛋白或多肽，以便接到該抗體或者其抗原結合部位與其它一種分子(例如親和素核心區域，或者多聚組氨酸標簽)的結合。常見的檢測標簽包括但不限于:放射性同位素(例如125I，131I，35S or 3H),熒光復合物(例如熒光素，二氯三嗪氨熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，5- 二甲氨基-1-萘磺酰氯苯，熒光素PE，稀土發光物，傘形酮，丹磺酰氯)，以及酶(例如辣根過氧化物酶，O-半乳糖苷酶，β -半乳糖苷酶，熒光素酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，乙酰膽堿酯酶)。在進一步的操作實例中，本發明所述抗體或者其部分可以被標記生物素，或者已經證明可以被另一個報告分子(例如亮氨酸拉鏈配對區域，二抗結合位點，金屬集合結構域，表位標簽)識別的多肽表位。在更進一步的操作實例中，任意一種抗體或者其部分可以利用聚乙烯醇(PEG)，甲基或乙基或者糖基經行修飾。抗B-Raf抗體或者其抗原結合部位的診斷用途本發明的一個方面是使用所述的抗B-Raf抗體或者其抗原結合部位作為一種癌癥診斷試劑。癌癥指的是任意一種惡性腫瘤，包括任何階段和級別的癌癥。可能用本發明的單克隆抗體診斷的癌癥具體例子包括但是不限于:黑色素癌，甲狀腺癌(例如甲狀腺乳頭狀癌)，胰腺癌，食道癌，結腸癌，直腸癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌(例如非小細胞肺癌)，腦癌，肝癌，胃癌或者造血組織癌(例如毛細胞白血病)。診斷包括檢測癌癥的發展程度，確認癌癥的存在，或者癌癥的分型或分類。在一些操作實例中，本發明可以提供一種診斷目標中癌癥的方法，其步驟包括:用本發明所述的抗B-Raf單克隆抗體接觸來自于檢測目標的生物學樣本；檢測抗體或者其部分與樣本是否結合；如果抗體與樣本存在結合則表明被檢測主體是癌癥，或者存在發展成癌癥的風險。檢測的樣本可以是血液，血清，淋巴，組織(例如穿刺或者甲醛和石蠟固定的包被切片)。抗體結合到樣本上與否可以用常見的的已知技術檢測，包括但是不限于:ELISA，RIA,流式細胞，免疫細胞化學，免疫組織化學，免疫熒光，免疫印跡，或者免疫共沉淀。抗B-Raf抗體或者其部分也可以用一種可以檢測的標記物直接標記。如果抗體沒有被標記，則可以使用一種能夠結合B-Raf抗體并能夠被檢測到的二抗或者其它分子。根據已有的常識，特定的二抗能夠特異性地結合特定的種類和亞型的一抗。例如，如果抗B-Raf抗體是一種小鼠IgG，則二抗必須是一種標記的抗小鼠IgG的抗體。其它能夠結合抗體的分子包括但是不限于Protein A和Protein G。他們都有多種商業化的形式。例如來自Pierce公司的Protein A和Protein G。適合用來標記抗體或者二抗的分子包括但是不限于:酶,輔基，熒光材料，發光材料，磁性材料以及放射性材料(見上文描述)。在一些操作實例中，本發明的抗體或者其部分可以提供在一種包含檢測抗體結合試劑的試劑盒中。抗B-Raf抗體或者其部分還可以用來檢查癌癥病人的發展進程，然后決定采取哪一種治療治療方案。例如在治療方案的伴隨檢測中。醫務人員可能根據B-Raf突變的檢測結果來決定對特定病人最優的治療方案。治療方案可以是手術,放射性治療,藥物治療(包括化學治療與靶向治療)，或者以上多種治療方式的結合。舉例來說，本發明包括一種治療癌癥病人的方法，其特征在于包括:檢查來自病人的生物樣本是否帶有V600E、V600K或者N581S突變；如果存在某種突變則對病人給予B-Raf抑制劑治療。B-Raf抑制劑可能是一種siRNA，反義RNA，微小RNA藥物，抗B-Raf抗體或者小分子化合物。例如，B-Raf抑制劑可以是威羅菲尼片(ZELB0RAF )，索拉非尼(BAY43-9006，NEXAVAR )，帕尼單抗，⑶C-0879，PLX-4720，GSK211843 6/SB590885，AZ628，RAF265 (CHIR-265)或者 XL281。在給予病人抗B-Raf藥物的靶向治療之前檢測是否存在B-Raf突變對于治療十分有意義。抗B-Raf抗體及其抗原結合部位的治療應用本發明同樣提供一種抗體及其抗原結合部位作為治療性藥物的應用包括用本發明的抗體或者其部分作為治療人類的應用，以及使用抗體或者其部分作為制造用于治療人類癌癥藥物的應用。這些人類癌癥包括黑色素癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，結腸癌，直腸癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，腦癌，肝癌，胃癌或者造血組織癌。詳細的癌癥種類亦可參閱上文的描述。在一些操作實例中，醫務人員給予能夠對特定疾病達到有效劑量的本發明的抗體或者部分，一般是一種嵌合的或者人源化的抗體或者部分，從而實現減緩或者治療該疾病，防止癌癥轉移或者進一步發展。抗體的給藥方式可以是例如:注射或者浸注。抗體或者部分的劑量可以由醫務人員決定，大致范圍為0.1到100毫克/公斤體重，更優地為0.5到50毫克/公斤體重，更優地為I到20毫克/公斤體重，更優地為I到10毫克/公斤體重。治療的效果可以通過監測例如腫瘤體積縮小的程度來說明。本發明的治療性藥物的成分除了所述的單克隆抗體或者其部分以外，可能包括一種可接受的藥劑載體。可接受的藥劑載體其特征在于，可以是一種溶劑，分散劑，包被劑，抗菌劑和抗真菌劑，滲透平衡劑和吸附延緩劑，其特征是具有生理兼容性。在很多情況下，優先的載體包括滲透平衡劑，例如糖類，多聚醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉組分。其它可以接受的藥劑材料包括濕潤劑或者少量的輔劑，例如濕潤劑，乳化劑，保護劑或緩沖液，它們能夠增加抗體的保質期或者效果。在一些操作實例中，本發明的抗B-Raf抗體或者其部分被與其它一種和/或者多種治療藥物，診斷藥物，或者預防劑混合在一起。治療藥物包括但不限于具有不同細微特異性差異的結合不同靶標的抗B-Raf抗體，以及B-Raf抑制劑，例如抑制劑可以是威羅菲尼片(ZELB0RAF ),索拉非尼(BAY43-9006，NEXAVAR )，帕尼單抗，⑶C-0879(Hoeflich et al.，Cancer Res,69(7):3042-3051(2009)), PLX-4720(Tsai etal.PNAS,105:3041 - 3046(2004)), GSK2118436/SB590885(Kefford et al., J Clin Oncol2010;28: (suppl;abstr 8503)), AZ628, RAF265(CHIR-265)(Mordant et al., Mol CancerTher 2010;9:358-368(2010)，Su et al., Clin Cancer Res, 18(8):2184-2198(2012))或者 XL281 (Schwartz et al.，J.Clin.0ncol.，27 (Suppl):3513.39 (2009))。本發明的藥劑組成可能含有一種“治療有效劑量”或者“預防有效量”的本發明的抗體或者抗原結合部位。“治療有效劑量”是指在一定的療程和劑量下，要達到有治療效果的有效藥物量。抗體及其抗原結合部分的治療有效劑量可能根據多種因素，例如疾病進程，年齡，性別，體重，以及抗體或者抗體部分能夠在個體內所引起的反應能力而有所不同。治療有效劑量也包含了該抗體或者抗原結合部位的有利作用強于任何毒性或者不利作用的意思。“預防有效量”是指在一定的療程和劑量下，要達到有預防效果的有效藥物量。通常由于預防藥物都是在疾病發生之前或者疾病早期使用，因此預防有效量可能會小于治療有效量。除非特別聲明，這里所用的所有的技術或者科學屬于都與一般熟知本發明領域的人員的常識相一致。可效仿的方法和材料在下面將進行詳細描述，盡管與這里描述的相似或者同樣的方法和材料也可以用來檢驗本發明。所有的參考文獻都詳細列出。盡管引用了大量的文獻，但是這些引用并不表明承認任何文獻是該領域的常識。本專利描述過程中使用的“包含” “包括”應當被理解為表明包含所述的完整對象或者群體對象，而不是排除任何其他的對象或者群體對象。材料、方法和實例僅是為了說明本發明的技術方案，并非限制。以下實例是為了描述本發明的方法與材料。對描述的條件或參數適當的修改或者同等替換通常符合本領域技術人員的明顯常識，因此依然屬于本發明的精神和范圍。


圖1顯示保藏號為CCTCC C2012112的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf N581S蛋白，卻不能結合野生型的B-Raf蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型B-Raf蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型B-Raf N581S蛋白。泳道3含有HEK293T細胞表達的野生型B-Raf蛋白。泳道4含有HEK293T細胞表達的突變型B-RafN581S蛋白。圖2 顯示保藏號為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285 的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf V600E蛋白，卻不能結合野生型的B-Raf蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型B-Raf蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型B-Raf V600E蛋白。泳道3含有HEK293T細胞表達的野生型B-Raf蛋白。泳道4含有HEK293T細胞表達的突變型B-Raf V600E蛋白。圖3顯示保藏號為CCTCC C2012122的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf V600K蛋白，卻不能結合野生型的B-Raf蛋白的免疫印染實驗圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達的野生型B-Raf蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達的突變型B-Raf V600K蛋白。泳道3含有HEK293T細胞表達的野生型B-Raf蛋白。泳道4含有HEK293T細胞表達的突變型B-RafV600K蛋白。圖4顯示保藏號為CCTCC C2012112的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf N581S蛋白，卻不能結合野生型B-Raf蛋白的免疫熒光實驗圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號分別指示野生型B-Raf (上面)和突變型B-Raf N581S蛋白(下面)的表達。紅色熒光信號能夠指示該抗體與B-Raf蛋白的結合，并且只在表達B-Raf N581S蛋白的細胞(下面)中出現。圖5 顯示保藏號為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285 的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf V600E蛋白，卻不能結合野生型B-Raf蛋白的免疫熒光實驗圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號分別指示野生型B-Raf (上面)和突變型B-Raf V600E蛋白(下面)的表達。紅色熒光信號能夠指示該抗體與B-Raf蛋白的結合，并且只在表達B-Raf V600E蛋白的細胞(下面)中出現。圖6顯示保藏號為CCTCC C2012122的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf V600K蛋白，卻不能結合野生型B-Raf蛋白的免疫熒光實驗圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號分別指示野生型B-Raf (上面)和突變型B-Raf V600K蛋白(下面)的表達。紅色熒光信號能夠指示該抗體與B-Raf蛋白的結合，并且只在表達B-Raf V600K蛋白的細胞(下面)中出現。圖7保藏號為CCTCC C2012112的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf N581S蛋白，卻不能結合野生型B-Raf蛋白的免疫組織化學實驗圖譜。棕色信號指示抗體結合到癌細胞中的B-Raf N581S突變蛋白上。藍色信號指示細胞核。圖8 保藏號為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285 的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf V600E蛋白，卻不能結合野生型B-Raf蛋白的免疫組織化學實驗圖譜。棕色信號指示抗體結合到癌細胞中的B-Raf V600E突變蛋白上。藍色信號指示細胞核。圖9保藏號為CCTCC C2012122的細胞株產生的抗體特異性結合B-Raf V600K蛋白，卻不能結合野生型B-Raf蛋白的免疫組織化學實驗圖譜。棕色信號指示抗體結合到癌細胞中的B-Raf V600K突變蛋白上。藍色信號指示細胞核。
具體實施例方式實施例1特異性結合B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的生產含有B-Raf突變蛋白氨基酸序列的多肽通過合成獲得。詳細的多肽序列在下表中列出，相對野生型蛋白的突變氨基酸加下劃線標示:表1突變的B-Raf多肽
權利要求
1.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，不能識別B-Raf野生型蛋白的單克隆抗體，或者抗原結合蛋白，該單克隆抗體特異性識別的B-Raf突變蛋白包括:第581位的天冬酰胺(Asparagine, N)突變為絲氨酸(Serine, S)的突變蛋白(B-Raf N581S)；第600位的纈氨酸(Valine，V)突變為谷氨酸(Glutamic Acid, E)的突變蛋白(B-RafV600E);或者第600位的纈氨酸(Valine，V)突變為賴氨酸(Lysine，K)的突變蛋白(B-RafV600K)。
2.根據權利要求1所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結合于含有多肽序列SEQ ID NO:3的B-Raf蛋白。
3.根據權利要求1所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結合于含有多肽序列SEQ ID NO:1的B-Raf蛋白。
4.根據權利要求1所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結合于含有多肽序列SEQ ID NO:2的B-Raf蛋白。
5.根據權利要求1所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結合部位，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列分別是由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC C2012112、CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC/C201285 以及 CCTCC C2012122 的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列決定。
6.根據權利要求5所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結合部位，所述雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體重鏈和輕鏈的組成分別包含重鏈和輕鏈的可變區域。
7.根據權利要求5所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結合部位，包含有所述的雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列。
8.根據權利要求1所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，包括抗原結合部位，是一種人源化或者嵌合型抗體。
9.根據權利要求2至6及8任一項所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述單克隆抗體是一種IgG。
10.根據權利要求1所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCCC2012112、CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285 以及 CCTCCC2012122 的三株雜交瘤細胞。
11.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，該單克隆抗體或者抗原結合部位的藥物，以及可以藥用的載體。
12.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種診斷B-Raf突變的診斷試劑盒，其組成含有權利要求1至7所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結合部位。
13.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種診斷腫瘤的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)用權利要求1至7所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結合部位接觸需要檢測的生物樣本；(2)檢測單克隆抗體或者抗原結合部位是否與樣本發生結合，而結合指示樣本存在癌癥或者發展成癌癥的風險。
14.根據權利要求13所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，所述診斷方法中，常見的癌癥類型包括:直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。
15.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種治療癌癥病人的方法，其特征在于: (1)檢測來自于病人的生物學樣品中是否含有B-RafN581S, V600E或者V600K突變，并且 (2)如果存在上述突變，對該病人給予B-Raf蛋白抑制劑的治療。
16.根據權利要求15所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，所述治療方法中，B-Raf蛋白抑制劑包括:反義RNA (antisense RNA)，小干涉RNA(siRNA),微小RNA (miRNA)藥物，抗B-Raf單克隆抗體藥物，帕尼單抗(panitumumab),威羅菲尼(vemurafenib),索拉非尼(Sorafenib),西妥昔單抗(Cetuximab), Raf-265,PLX-4032,⑶C-0879。
17.根據權利要 求15所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，所述治療癌癥病人的方法，給予病人含有權利要求11的組成成分的藥物。
18.根據權利要求15或17所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，所述治療癌癥病人的方法中，常見的癌癥類型包括:直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。
19.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，將權利要求1至8的單克隆抗體或者抗原結合部位用于癌癥治療藥物的生產過程，常見的癌癥種類包括:黑色素癌，直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血組織癌。
20.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種純化的核酸分子，包含能夠編碼權利要求1至8所述單克隆抗體的重鏈或者其一個抗原結合部位，或者能夠編碼輕鏈或者其一個抗原結合部位，或者能夠同時編碼二者的核酸序列。
21.根據權利要求20所述的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種載體分子，含有可以聯系到該核酸分子的表達調控序列。
22.根據權利要求20的特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種宿主細胞，含有該核酸分子。
23.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，包含權利要求1至7的一種細胞株，其含有所述的單克隆抗體或者其抗原結合部位。
24.特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應用，其特征在于，一種生產單克隆抗體或者其抗原結合部位的方法，所生產的抗體或者抗原結合部位特異性結合人類突變的B-Raf蛋白，而不結合人類野生型的B-Raf蛋白。其步驟包括: (1)根據權利要求22，在適當的條件下培養該宿主細胞，或者根據權利要求23，在釋放的條件下培養該細胞株； (2)提純所述的抗體部分。
全文摘要
本發明公開了特異性識別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應用，屬于生物科學和藥物載體領域。利用本發明的方法制備出的三種單克隆抗體分別可以特異性識別三種B-Raf N581S，B-Raf V600E和B-RafV600K突變蛋白。這三種單克隆抗體可以用于檢測動物或者人體組織中的B-Raf蛋白是否含有N581S、V600E和V800K突變，能為臨床上皮膚癌等多種癌癥的診斷和治療提供依據。
文檔編號A61P35/00GK103172744SQ20121036760
公開日2013年6月26日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者黃新云 申請人:武漢紐斯特生物技術有限公司