一種組織工程天然凝膠支架材料及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了豆腐柴葉在制備組織工程天然凝膠支架材料中的應用，提供了一種組織工程天然凝膠支架材料制備方法，步驟簡單易行，無需大型設備，采用水相反應無毒無害，不污染環境，在工業上有很高的應用前景和實用價值。按照本發明制備方法制得的組織工程天然凝膠支架材料與傳統的凝膠支架相比，具有大量孔洞結構，具有很好的生物相容性的同時具有很好的力學性能，使用壽命長。
【專利說明】一種組織工程天然凝膠支架材料及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于組織工程領域，具體涉及一種組織工程天然凝膠支架材料制備方法和應用。 【背景技術】
[0002]生物材料和種子細胞是組織工程技術中的兩大關鍵因素。作為種子細胞支架的生物可降解材料，是對細胞外基質的仿生，是保證組織工程化組織形成的前提。細胞與生物材料直接接觸后，產生一系列在細胞和分子水平上的反應，因此支架材料的物化性質直接影響著細胞增殖和分化，進而影響體內和體外組織構建效果，最終影響組織工程化組織的形成。由于生物材料在組織工程中是起到負載細胞的支架的作用，一般需要具有相應組織、器官的復雜外形，高空隙率，合適的降解速率，良好的生物相容性。
[0003]目前可供使用的支架材料有:膠原、纖維蛋白、殼聚糖、透明質酸、蠶絲、明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸和聚酸配等。這些材料來源豐富、造價低，但是生物相容性以及力學強度仍難以滿足組織工程臨床應用的需求。因此本領域迫切需要提供一種簡單易行、能夠精確控制凝膠性能的組織工程天然凝膠支架材料的制備方法。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于克服現有技術中的不足，公開豆腐柴葉在制備組織工程天然凝膠支架材料中的應用。
[0005]本發明的第二個目的在于公開一種組織工程天然凝膠支架材料制備方法。
[0006]本發明的第三個目的在于提供一種組織工程天然凝膠支架材料。
[0007]本發明的第四個目的在于提供一種組織工程天然凝膠支架材料在組織工程移植物中的應用。
[0008]本發明的上述目的通過如下技術方案予以實現:
豆腐柴葉在制備組織工程天然凝膠支架材料中的應用。
[0009]豆腐柴是一種藥食兼用植物，豆腐柴葉富含膠、蛋白質和纖維素，葉綠素和維生索C，特別是果膠含量高。果膠、糖及水富含的羧基可以形成氫鍵交聯，確保凝膠結構的形成。果膠分子上帶有數目不等的羧基集團和不帶電荷的甲氧基基團，羧基基團以不帶電荷的-COOH及帶負電荷的-C00-形式存在，帶負電荷的基團可以與其它帶正電荷的物質(如蛋白質、金屬離子等)發生反應，果膠中的高聚半乳糖醛酸(HG)部分交聯可以形成一個三維晶型網狀結構，水和其它溶質被包裹在網格之中時，果膠就會形成凝膠。
[0010]豆腐柴經過一定工藝步驟除雜，分離得到的凝膠液可以用于制備天然凝膠支架材料。細胞實驗和力學測試結果表明，豆腐柴葉制得的天然凝膠支架材料對細胞有非常好的相容性，同時凝膠支架材料的力學強度較大，可以滿足組織工程臨床應用的需求。
[0011]一種組織工程天然凝膠支架材料制備方法，包括如下步驟:
S1.取豆腐柴葉研磨，離心取上清液與乙醇混合，震蕩混合均勻，再次離心得到提取液；
52.將步驟SI制得的混合液裝入準備好的半透膜在超純水中進行透析，透析完畢的提取液平鋪、干燥，得到組織工程凝膠支架材料。
[0012]步驟SI中所述離心的條件為以4000~5000 r/min的轉速離心5~lOmin。
[0013]步驟S2中所述透析的條件為每4小時換水一次,總透析時間為72小時。
[0014]步驟S2中所述干燥為冷凍干燥，冷凍干燥時間為48~72小時；在冷凍干燥前，透析液先在-4°C環境下預凍2~3小時，然后置于_80°C的環境下繼續冷凍24~36小時。
[0015]一種根據上述制備方法制備得到的組織工程天然凝膠支架材料。
[0016]所述組織工程天然凝膠支架材料為片狀或顆粒狀，含有果膠多糖的重量百分比為I~25%。
[0017]根據上述制備方法制備得到的組織工程天然凝膠支架材料在組織工程移植物中的應用。
[0018]所述組織工程移植物為軟骨移植物或結締組織移植物。
[0019]所述組織工程移植物的制備步驟如下:
53.將步驟2制得的組織工程凝膠支架材料粉碎，用35目篩網過濾得凝膠顆粒，所得凝膠顆粒的粒徑為500 μ m以下；
54.將步驟S3制得的凝 膠 顆粒與含有海藻酸鈉-酪蛋白的溶液混合，所述溶液和凝膠顆粒的體積比為;
55.將含有種子細胞的細胞懸液加入步驟S4制備得到的混合液中攪拌制得組織工程移植物。
[0020]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
本發明公開了豆腐柴葉在制備組織工程天然凝膠支架材料中的應用，提供了一種組織工程天然凝膠支架材料制備方法，步驟簡單易行，無需大型設備，采用水相反應無毒無害，不污染環境，在工業上有很高的應用前景和實用價值。按照本發明制備方法制得的組織工程天然凝膠支架材料與傳統的凝膠支架相比，具有大量孔洞結構，具有很好的生物相容性的同時具有很好的力學性能，使用壽命長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為實施例1組織工程天然凝膠支架材料產品照片；
圖2為組織工程天然凝膠支架材料的細胞培養細胞活力檢測結果圖；
圖3為組織工程天然凝膠支架材料復合軟骨細胞后FDA染色圖(其中，圖2A為100倍放大，圖2B為40倍放大)。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0023]實施例1組織工程天然凝膠支架材料的制備
取豆腐柴葉30g，冰凍24小時，將冷凍過的豆腐柴葉及20ml去離子水放入研缽中，搗碎，邊研磨邊加水，直至成糊狀。將研磨好的豆腐柴汁液及殘渣裝入離心管中，以轉速4000r/min離心5min，然后將上清液吸出，殘渣裝入袋中，密封-4°C冷凍保存，以備后用。將粗提取得到的上清液加入50ml的90%乙醇中，震蕩混合均勻，然后裝入離心管中以轉速5000 r/min離心10min,然后將上清液吸出，取3ml上一步中得到的上清液滴加到lmol/L的CaCl2溶液中凝膠原理進行檢驗，如果無明顯凝膠現象，將得到的沉淀用水溶解，并在60°C環境中加熱，每半小時取出震蕩一次，讓液體混合均勻，處理2小時，然后重復提取至凝膠狀。將得到的凝膠提取液裝入截留分子量為8000-14000的半透膜中進行透析，透析時間48h，每4h換一次透析液。將透析完畢的凝膠提取液取出裝入小試管中用濾紙封好口，先在-4°C環境下預凍2小時，然后置于_80°C的環境下繼續冷凍36h，最后將冷凍處理過的凝膠提取液放入低溫冷凍干燥機中進行凍干處理，凍干處理48h即可得到的組織工程天然凝膠支架材料，產品如圖1所示。
[0024]實施例2組織工程移植物的制備
新鮮豬后腿剔除多余脂肪和肌肉，保留膝蓋軟骨和股骨，切斷十字韌帶，小心打開髕骨，暴露關節腔，繼續分離組織至完全顯露關節軟骨面，注意勿傷及關節軟骨。小心切取方形軟骨組織，用鑷子夾住浸泡于IOml PBS中清洗。取材完畢后，用雙抗清洗軟骨組織3遍，棄上懸液。將軟骨組織轉移至IOml培養皿中，用鑷子固定軟骨，移液槍去除液體。在培養皿中加入少量PBS，沒過組織即可，切碎軟骨組織，比米粒更小些的顆粒用槍頭將切碎組織移入50ml離心管中,搖勻清2-3次,倒去液體,加入約20ml完全培養基,輕輕搖晃,置于培養箱中4-6小時，倒去上清液，加入20ml II型膠原酶，培養箱中過夜。取培養瓶,分別加入培養基。將組織從培養箱中取出，離心(1400r/min, 5min),棄上清，加入15ml軟骨培養基后轉入培養瓶中，37°C 5%C02培養箱中孵育。培養箱中取出細胞，培養瓶中加入0.25%胰蛋白酶消化液3ml后培養箱中消化3min，消化后繼續培育，取第3代細胞用于組織工程移植物的制備。
[0025]將實施例1中制得的組織工程凝膠支架材料通過超聲波破碎儀粉碎，用35目篩網過濾得凝膠顆粒，所得凝膠顆粒的粒徑為400 μ m，制得的凝膠顆粒與含有海藻酸鈉-酪蛋白的溶液按3:1的體積比混合，將第3代軟骨細胞懸液加入凝膠顆粒混合液中，混合液移入直徑為10cm的培養皿中，放入37°C 5%C02培養箱中培養7天，每2天換一次培養基。由以上過程得到組織工程移植物。
[0026]實施例3組織工程凝膠支架材料用于軟骨細胞培養細胞毒性MTT檢測
將實施例2中得到的軟骨細胞的濃度配成lxl04Cell/mL，按100uL每孔接種于96孔板中，培養24小時后換成含I mg/ml由實施例1得到的組織工程天然凝膠支架(得到的經蒸汽滅菌后的凝膠支架顆粒)的培養液，單純DMEM培養基作為陰性對照，含649g/L苯酚的DMEM培養液作為陽性對照，每個樣本在每個時間點重復8個樣。分別培養2，4和7天后，每個孔板加入 100 μ L 的 0.5mg/ml 的 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) _2，5-diphenyItetrazolium bromide (MTT)溶液。37°C孵育4小時后，吸棄每個孔板中的培養液，加入150 μ L的DMSO (二甲基亞砜)。96孔板在搖床搖晃5分鐘后,把每個孔內的液體移至另一新96孔板，在免疫酶標儀上用490nm波長測定每孔的吸光值。結果如圖2所示。
[0027]結果表明，凝膠支架無細胞毒性，和陰性對照組即單純DMEM的增殖在不同時間點均無顯著性差別。隨著時間的增加，凝膠組的細胞和陰性對照組一樣，呈正常的增殖趨勢。因此，本發明提供的凝膠支架可用于負載細胞的組織工程支架。[0028]實施例4組織工程天然凝膠支架材料用于軟骨細胞培養FDA染色實驗
稱5mgFDA(二乙酸熒光素)加入ImL丙酮溶解，搖勻，避光4°C保存；使用時用PBS將FDA溶液稀釋1000倍，得到5Pg/mL FDA溶液，將實施例2中得到的組織工程移植物的培養基吸走，用無菌PBS溶液清洗三次，待用。在每孔材料中加入200μ1的FDA溶液，培養箱中放置lOmin，盡量避光；取出培養皿，吸去染色液，用PBS清洗三次，置于熒光顯微鏡下觀察。激發波長484nm,發射波長520nm。 [0029]結果見圖3結果表明，在凝膠材料內分布著密集的干細胞，細胞生長狀態好；細胞形態飽滿，可觀察到細胞在凝膠內部均勻分布生長。
【權利要求】
1.豆腐柴葉在制備組織工程天然凝膠支架材料中的應用。
2.一種組織工程天然凝膠支架材料制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.取豆腐柴葉研磨，離心取上清液與乙醇混合，震蕩混合均勻，再次離心得到提取液； 52.將步驟SI制得的混合液在超純水中進行透析，透析完畢后干燥即得到所述組織工程凝膠支架材料。
3.根據權利要求2所述組織工程天然凝膠支架材料制備方法，其特征在于，步驟S2中所述干燥為冷凍干燥。
4.根據權利要求2所述組織工程天然凝膠支架材料制備方法，其特征在于，步驟SI中所述離心的條件為以4000~5000 r/min的轉速離心5~lOmin。
5.根據權利要求2所述組織工程天然凝膠支架材料制備方法，其特征在于，步驟S2中所述透析的條件為每4小時換水一次，總透析時間為72小時。
6.一種根據權利要求2所述組織工程天然凝膠支架材料制備方法制備得到的組織工程天然凝膠支架材料。
7.根據權利要求6所述組織工程天然凝膠支架材料，其特征在于，所述組織工程天然凝膠支架材料為片狀或顆 粒狀，含有廣25%重量百分比的果膠多糖。
8.根據權利要求2所述組織工程天然凝膠支架材料制備方法制備得到的組織工程天然凝膠支架材料在組織工程移植物中的應用。
9.根據權利要求8所述組織工程天然凝膠支架材料在組織工程移植物中的應用，其特征在于，所述組織工程移植物為軟骨移植物或結締組織移植物。
10.根據權利要求8或9所述組織工程天然凝膠支架材料在組織工程移植物中的應用，其特征在于，所述組織工程移植物的制備步驟如下: s3.將步驟2制得的組織工程凝膠支架材料粉碎，用35目篩網過濾得凝膠顆粒； S4.將步驟S3制得的凝膠顆粒與含有海藻酸鈉-酪蛋白的溶液混合，所述溶液和凝膠顆粒的體積比為; S5.將含有種子細胞的細胞懸液加入步驟S4制備得到的混合液中攪拌制得組織工程移植物。
【文檔編號】A61L27/36GK103599566SQ201310494942
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】龔逸鴻, 徐勇, 何帆, 李燕, 蔣慶 申請人:中山大學