抑制酪蛋白激酶2活性在促進i型干擾素表達的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫學治療領域。具體地，本發明涉及酪蛋白激酶2抑制劑在促進I 型干擾素及其下游基因表達中的新用途。
【背景技術】
[0002] I型干擾素包括IFNa和IFN0兩種，它們與細胞表面的干擾素受體結合后激活蛋 白激酶Jakl和Tyk2,隨后活化轉錄因子STAT1或/和STAT2,誘導上百種基因的表達（干 擾素誘導基因，ISGs)，包括MX1、MX2、Rsad2/Viperine、CXCL10/IP-10 等。
[0003] 干擾素誘導的這些基因在細胞的繁殖和凋亡、血管生成、T細胞免疫反應等過程中 起著重要的生理作用。因此I型干擾素在免疫相關性疾病中的應用得到了廣泛的研究。
[0004] I型干擾素的表達是受模式識別受體（PRRs，PatternRecognitionReceptors)及 其介導的信號通路所誘導的。這些模式識別受體包括Toll樣受體（Toll-likereceptors/ TLRs)、NOD樣受體（NOD-1ikereceptors/NLRs)、RIG-I樣受體（RIG-I-1ikereceptors/ RLRs)和胞衆內DNA受體（cytosolicDNAsensors，Q)Ss)通過識別組織中死亡的細胞所 分泌的RNA和DNA等"模式分子"（PAMPs，Pathogen-AssociatedMolecularPatterns)，激 活復雜的信號通路（包括蛋白激酶TBK1、IKKα/β和MAPkinases)，活化關鍵性的轉錄因 子IRF3、NFκB和AP-1等，誘導I型干擾素、細胞因子和趨化因子的表達，激活天然免疫和 適應性免疫反應，實施宿主防御和組織修復等生理功能。
[0005] 但是I型干擾素表達過量或異常也會引起疾病，特別是系統性紅斑狼瘡等自身免 疫性疾病，因此體內往往存在調控I型干擾素的負調節機制，以避免干擾素的異常表達。這 些調控機制往往導致在病理狀態下，I型干擾素也不能有效的表達，從而導致各種免疫反應 不足的相關性疾病。因此如何在病理狀態下，突破機體調控I型干擾素表達的機制，從而有 效地治療免疫相關性疾病，是基礎和臨床醫學領域研究的一個重要課題。
[0006] 因此，本領域迫切需要開發一種提高人體自身I型干擾素表達，提高人體免疫功 能的有效方法，以治療多種感染性和非感染性的人類疾病。

【發明內容】

[0007] 本發明提供了一種CK2抑制劑在促進I型干擾素表達中的應用。
[0008] 本發明第一方面，提供了一種酪蛋白激酶2(Caseinkinase2,CK2)抑制劑的用 途，（i)用于制備促進I型干擾素（IFNa/β)和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白表達的 藥物組合物；和/或（ii)用于制備治療和/或預防I型干擾素缺乏相關疾病的藥物組合 物。
[0009] 在另一優選例中，所述的CK2來源于哺乳動物，較佳地，來源于人、小鼠、大鼠。
[0010] 在另一優選例中，所述的I型干擾素缺乏是指在疾病發生前和或/疾病發生后，I 型干擾素表達量和/或活性的降低。
[0011] 在另一優選例中，所述的I型干擾素缺乏相關疾病是指缺乏I型干擾素會導致疾 病的發生和/或加重、且提高I型干擾素的表達量和/或活性后能夠對所述疾病起到治療 和/或預防作用的疾病。
[0012] 在另一優選例中，所述的抑制劑包括CK2的反義核酸、抑制性microRNA、抗體或小 分子化合物。
[0013] 在另一優選例中，所述的抗體包括小分子多肽。
[0014] 在另一優選例中，所述的抑制劑為CK2基因的siRNA、shRNA。
[0015] 在另一優選例中，所述的CK2基因的shRNA如（SEQIDNO. : 1-2所示）
[0016]Forward(SEQIDNO. :1):
[0017] 5'CCGGCCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGGTTTTTG3' ；
[0018] Reverse(SEQIDNO. :2):
[0019] 5' AATTCAAAAACCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGG 3'。
[0020] 在另一優選例中，所述的CK2蛋白的氨基酸序列的Genbank登錄號為 ΝΡ_031814· 2 (小鼠）和ΝΡ_808227· 1 (人）。
[0021 ] 在另一優選例中，所述的CK2蛋白的編碼核苷酸序列的Genbank登錄號如ΝΜ_007788· 3 (小鼠）和NM_177559 (人）所示。
[0022] 在另一優選例中，所述的I型干擾素缺乏相關疾病包括：病毒感染性疾病、惡性腫 瘤、多發性硬化。
[0023] 在另一優選例中，所述的病毒感染性疾病包括感染了以下的病毒的疾病：單純皰 疹病毒（HSV)、水泡病毒（VSV)、卡波希氏瘤皰疹病毒（KSHV)、呼吸道合胞病毒（RSV)、手足 口病病毒（腸道病毒EV71和CA16)乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人類獲得性 免疫缺陷病毒/艾滋病病毒（HIV);和/或
[0024] 所述的惡性腫瘤包括以下腫瘤：多毛細胞白血病（hairycellleukaemia)、慢 性髓性白血病（CML)、淋巴瘤（lymphoma)、骨髓瘤（myeloma)、黑色素瘤（melanoma)、腎細 胞癌與膀脫癌（renalcellandbladdercellcarcinoma)、卡波希氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)〇
[0025] 在另一優選例中，所述的病毒為感染細胞后能夠激活模式識別受體的病毒。
[0026] 在另一優選例中，所述的抑制劑還用于抑制病毒和/或腫瘤細胞的免疫逃逸。
[0027] 在另一優選例中，所述CK2抑制劑還用于抑制病毒的復制和組裝。
[0028] 在另一優選例中，所述的I型干擾素和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白的表達 包括誘導產生和/或提高I型干擾素和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白的表達量和/或 活性。
[0029] 在另一優選例中，所述的抑制劑為小分子化合物，較佳地，包括四溴苯三唑（TBB)、 CX-4945(Silmitasertib)、DMAT(2-二甲氨基-4, 5, 6, 7-四溴-1H-苯并咪唑）、山奈酚、 酪氨酸磷酸化抑制劑AG114(TyrphostinAG114)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4_甲苯基）噻 吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫基]丙酸（TTP22)、CX-5011、鞣花酸（EllagicAcid)、3-甲 基-1，6, 8-三氫蒽醌（emodin)、4'，5, 7-三羥基黃酮（apigenin)。
[0030] 在另一優選例中，所述的I型干擾素誘導基因或其蛋白包括CXCL10/IP-10、 STAT1、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、磷酸激酶TBK1、干擾素調節因子 3 (IRF3)。
[0031] 在另一優選例中，所述的I型IFN包括IFN-α、IFN-β。
[0032] 在另一優選例中，所述的藥物組合物包括作為活性成分的CK2抑制劑，和藥學上 可接受的載體。
[0033] 在另一優選例中，所述的CK2抑制劑的有效濃度為1-1000μM，較佳地，為 20-100 μΜ〇
[0034] 在另一優選例中，所述的CK2抑制劑對I型干擾素和/或I型干擾素誘導基因或 其蛋白的促進作用呈劑量依賴性。
[0035] 本發明第二方面，提供了一種體外非治療性的促進細胞表達I型干擾素和/或I 型干擾素誘導基因或其蛋白和/或體外非治療性的抑制I型干擾素缺乏相關病毒細胞和/ 或腫瘤細胞生長的方法，包括步驟：在CK2抑制劑的存在下，培養細胞，從而促進細胞表達I 型干擾素和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白抑制I型干擾素缺乏相關病毒細胞和/或腫 瘤細胞生長。
[0036] 在另一優選例中，所述的細胞包括腫瘤細胞、或為DNA或RNA病毒感染的細胞。
[0037] 在另一優選例中，所述的方法還可用于制備I型干擾素或其誘導蛋白，例如收集 并純化細胞培養體系中獲得的I型干擾素或其誘導蛋白。
[0038] 本發明第三方面，提供了一種篩選能夠抑制CK2的化合物的方法，包括步驟：
[0039] (a)在試驗組中，向細胞培養體系加入待測化合物，并測定I型干擾素的表達量和 /或活性；在對照組中，向細胞培養體系不加入待測化合物，并測定I型干擾素的表達量和/ 或活性；
[0040] 其中，若試驗組中I型干擾素的表達量和/或活性顯著高于對照組，則說明所述的 候選化合物為能夠抑制CK2的化合物和/或
[0041] (a2)在試驗組中，向病毒感染的細胞培養體系中加入待測化合物，并測定細胞培 養體系中病毒的滴度；在對照組中，向病毒感染的細胞培養體系中加入待測化合物，并測定 細胞培養體系中的病毒滴度；
[0042] 其中，若試驗組病毒的滴度顯著低于對照組，則說明所述的候選化合物為能夠抑 制CK2的化合物。
[0043] 在另一優選例中，所述的方法還包括步驟：
[0044] (b)對（a)中的化合物進一步測試其對酪蛋白激酶2或I型干擾素誘導基因或其 蛋白的促進作用。
[0045] 本發明第四方面，提供了一種制備I型干擾素的方法，包括步驟：
[0046] ⑴在CK2抑制劑的存在下培養細胞；
[0047](ii)收集、分離并純化細胞培養液中的I型干擾素。
[0048] 在另一優選例中，在L929細胞中加入CK2抑制劑，在非感染條件下培養12-48小 時或者在病毒感染條件下培養12-24小時。收集上清，利用HPLC純化I型干擾素。
[0049] 在另一優選例中，所述的細胞還包括成纖維細胞、或巨噬細胞。
[0050] 本發明第五方面，提供了一種CK2基因或其蛋白的用途，用于制備降低I型干擾素 和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白表達的藥物組合物。
[0051] 本發明第六方面，提供了一種治療病毒性感染的方法，向需要治療的對象施用CK2 抑制劑，從而治療病毒性感染。
[0052] 在另一優選例中，所述需要治療的對象為哺乳動物，較佳地，為人。
[0053] 本發明第七方面，提供了一種（i)治療I型干擾素缺乏相關疾病；和/或（ii)促 進I型干擾素和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白表達的藥物組合物，所述的藥物組合物 包括作為活性成分的CK2抑制劑，和藥學上可以接受的載體。
[0054] 本發明第八方面，提供了一種判斷CK2抑制劑是否對腫瘤或病毒有效的方法，包 括步驟：
[0055] (a)向腫瘤細胞或病毒感染細胞培養體系中加入CK2抑制劑；
[0056] (b)觀察加入CK2抑制劑前后所述培養體系中I型干擾素的表達量和/或活性；
[0057] 其中，當加入CK2抑制劑后I型干擾素的表達量和/或活性II較加入之前的表達 量和/或活性10有顯著升高，則說明CK2抑制劑對該腫瘤或病毒具有抑制作用。
[0058] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0059] 圖1顯示了CK2抑制Toll樣受體信號所誘導的I型干擾素和/或I型干擾素誘 導基因或其蛋白，但不影響炎癥因子TNFa的表達。
[0060] 圖2顯示了CK2抑制Toll樣受體信號所誘導的TBK1和IRF3活化，但不影響MAP kinases的激活。
[0061] 圖3顯示了CK2抑制胞漿內識別RNA和DNA的模式識別受體所誘導的信號通路以 及I型干擾素和/或I型干擾素誘導基因或其蛋白的表達。
[0062] 圖4顯示了HSV感染時，CK2抑制小鼠巨噬細胞系Raw表達I型干擾素和/或I 型干擾素誘導基因或其蛋白，而隨著I型干擾素及其靶基因產物的大量表達，HSV病毒的復 制、組裝和釋放受到顯著的抑制，在CK2α敲降的Raw264. 7細胞培養液中檢測到的HSV病 毒滴度比對照組的要低接近10倍。
[0063] 圖5顯示了仙臺病毒感染時，CK2抑制小鼠成纖維細胞系L929表達I型干擾素和 /或I型干擾素誘導基因或其蛋白。
[0064] 圖6顯示了VSV病毒感染時，CK2抑制小鼠成纖維細胞系L929表達I型干擾素和 /或I型干擾素誘導基因或其蛋白。