本發明屬于生物技術領域，特別是涉及腫瘤治療的聯合用藥。

背景技術：

惡性腫瘤是目前致死率最大的疾病之一，常規治療手段如手術切除、放療和化療等手段較多應用于腫瘤治療中，但目前這些手段在治療腫瘤中有其局限性，且很難徹底治愈腫瘤，尤其是一些轉移型惡性腫瘤。

化療是目前治療腫瘤的有效手段之一。達卡巴嗪是化學名稱為：5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸櫞酸鹽。其在體內分解能放出甲基正離子(ch3)+，發揮烷化作用；同時又能變成一種與嘌呤生物合成的中間產物相似的物質，可能干擾嘌呤的生物合成。目前臨床用于治療黑色素瘤，對肺鱗癌和未分化癌、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等亦有一些治療作用。作為腫瘤化療藥物，其副作用較大，用藥同時常伴隨有白細胞減少、血小板減少、食欲不振、惡心、嘔吐、全身不適，肌肉酸痛、高熱等。也可有面部麻木、脫發，有的病人可有肝腎功能失常。

腫瘤免疫治療一直以來是腫瘤治療的研究熱點。目前腫瘤免疫治療的手段主要有t細胞過繼療法(adoptivecelltherapy,act)、免疫檢測點阻斷療法(抗pd-1，抗pd-l1和抗ctla-4抗體治療)、腫瘤疫苗以及嵌合抗原受體t細胞治療(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy)等，這些方法雖然目前都已經在臨床研究上取得不錯的進展，但由于腫瘤細胞的異質性以及腫瘤微環境的復雜性，腫瘤免疫治療目前仍然面臨許多重要障礙。

cd8t細胞是腫瘤免疫治療的核心，是腫瘤的特異性殺傷細胞，其殺傷能力強弱以及在腫瘤組織中的浸潤情況直接與腫瘤的預后直接相關，而且直接關系腫瘤免疫治療的成敗。由于腫瘤微環境是一個免疫抑制的環境，cd8t細胞的功能受到腫瘤微環境的抑制，目前免疫檢測點阻斷抗體抗pd-1，抗pd-l1和抗ctla-4抗體在治療黑色素瘤的臨床試驗中雖然整體效果不錯，但單獨使用時各自的客觀反應率(objectiveresponserate)以及抗pd-1和抗ctla-4抗體聯合治療客觀反應率還是不盡如人意。這意味著急需發展新的靶點以進一步增強腫瘤中cd8t細胞的功能。

細胞內膽固醇代謝通路包括膽固醇合成、轉運以及儲存等途徑，其中膽固醇合成通路主要由scap/srebp復合物以及其下游膽固醇合成限速酶hmgcr調控；膽固醇的轉運途徑的 調控主要受低密度脂蛋白受體(ldlreceptor)、內體(endosome)和溶酶體(lysosome)中npc1/2等蛋白及復合物的調控；而膽固醇存儲則受膽固醇的酯化修飾以及去酯化修飾的調控，關鍵調控蛋白包括酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1/2和膽固醇酯水解酶(ceh)。已有研究表明，acat1是一個治療動脈粥樣硬化以及阿爾茨海默病的靶點，并已基于此開發了一些小分子抑制劑在進行臨床實驗，如avasimibe具有很好的臨床安全性。但是現有技術并沒有披露acat1與腫瘤治療之間的關聯。

技術實現要素：

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供可用于腫瘤治療的聯合用藥物組合。

本發明第一方面提供了一種用于腫瘤治療的聯合用藥物組合，包括有效量的酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和有效量的達卡巴嗪。

所述酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的抑制劑是指對于酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1具有抑制效果的化合物。

對于酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1活性，或者抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因轉錄或表達。

所述的酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑可為sirna、shrna、抗體、小分子化合物。

如本發明實施例列舉的，所述酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑選自：avasimibe、k604、cp113,818，所述酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑還可選自：purpactins、manassantina、diphenylpyridazinederivatives、glisoprenina、pactimibe、ci976、tmp-153、ym750、geri-bp002-a、sandoz58-035、vulm1457、cl-283,546、ci-999、e5324、ym17e,fr182980、pd132301-2、f-1394、hl-004、f-12511(eflucimibe)、cinnamicacidderivatives、dup128、rp-73163、pyripyropenec、fo-1289、as-183、spc-15549、beaui、beauiii、fo-6979、angelica、ginseng、decursin、terpendolec、beauvericin、spylidone、pentacecilides、cl-283,546、cinnamicderivatives、betulinicacid、shikoninderivatives、esculeogenina和wu-v-23等。

所述聯合治療藥物組合可以是以下形式中的任意一種：

一)將酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和達卡巴嗪分別制成獨立的制劑，制劑的劑型可相同或不同，給藥途徑亦可相同或不同。

二)將酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和達卡巴嗪配置成復方制劑。在將酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和達卡巴嗪采用相同給藥途徑給藥并同時施加時，可采用將兩者配置成復方制劑的形式。

本發明第二方面提供了一種腫瘤免疫治療聯合用藥治療方法，為向對象聯合施用有效量的酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑，以及有效量的達卡巴嗪。

所述的對象為哺乳動物或所述哺乳動物的cd8t細胞。所述哺乳動物優選為嚙齒目動物、偶蹄目動物、奇蹄目動物、兔形目動物、靈長目動物等。所述靈長目動物優選為猴、猿或智人。

所述對象可以是罹患腫瘤的患者或期待提高抗腫瘤免疫力的個體，或者為罹患腫瘤的患者或期待提高抗腫瘤免疫力的個體的離體cd8t細胞。

可以同步的或順序地給予有效量的酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和有效量的達卡巴嗪。

基于酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1為新發現的腫瘤免疫治療靶點，本發明經研究發現，在與達卡巴嗪聯合用藥中，兩者可以起到協同效果，進一步增強對于腫瘤的抑制。

所述腫瘤治療針對的腫瘤包括實體瘤和非實體瘤，包括但不限于：鼻腔及鼻竇惡性腫瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺腫瘤、顱內腫瘤、甲狀腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、賁門癌、乳腺癌、縱膈腫瘤、胃癌、大腸癌、乙狀結腸和直腸癌、肝癌、胰腺癌與壺腹周圍癌、膽道癌、小腸腫瘤、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、睪丸惡性腫瘤、陰莖癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病等。

在部分實施例中，所述腫瘤治療針對黑色素瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤。

所述酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑及免疫檢測點阻斷療法藥物可以在接受腫瘤免疫治療前、中、后向對象施用。

本發明的優點：

(1)通過一系列體外實驗，發現acat1在調控cd8t細胞免疫應答反應上起著關鍵作用，抑制acat1的活性可以增強cd8t細胞的抗原特異性免疫應答反應，增強其對靶細胞的殺傷能力，而不影響cd8t細胞對自身抗原的響應；

(2)經體外實驗發現抑制acat1活性增強cd8t細胞抗腫瘤能力；

(3)在動物水平上，t細胞特異性基因敲除acat1或者通過抑制劑抑制acat1活性可以增強cd8t細胞免疫應答能力，在小鼠黑色素瘤模型和小鼠肺癌模型中增強cd8t細胞的抗腫瘤活性；在與達卡巴嗪的聯合治療小鼠黑色素瘤實驗中，acat1抑制劑 avasimibe可以與達卡巴嗪協同促進cd8t細胞的抗腫瘤活性。

(4)現有技術雖然論證了酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑的用藥安全性，但是酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑原適應癥的臨床效果并不理想。本發明在腫瘤免疫治療領域給酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑提供了新的臨床應用價值，不僅為其進一步的市場應用開辟了廣闊的前景，也為腫瘤患者提供了更有效的治療方案。

附圖說明

圖1.acat1敲除增強ot-icd8t細胞對特異性抗原的免疫應答，且并不引發對自身抗原的免疫應答。

a.c57bl/6小鼠來源的脾臟細胞呈遞外來抗原(n4，a2,t4和g4)或者自身抗原(r4和catnb)后作為抗原遞呈細胞(antigen-presentingcell,apc)刺激野生型(wtot-i)或者acat1^ckoot-icd8t細胞(ckoot-i)。胞內染色和流式檢測細胞因子ifnγ的表達(n＝4)。

b.c57bl/6小鼠來源的脾臟細胞呈遞ova抗原(ova257-264)后作為抗原遞呈細胞刺激野生型(wtot-i)或者acat1^ckoot-icd8t細胞(ckoot-i)，5天后產生成熟的殺傷型t細胞(ctls)。為檢測ctl的細胞殺傷能力，用遞呈ova抗原的el-4作為靶細胞，與ctl混合培養4小時后，通過檢測ldh(lacticdehydrogenase,乳酸脫氫酶)的釋放來測定殺傷效率。

c.取3月齡小鼠血清，elisa方法檢測血清中細胞因子ifnγ和自身抗體抗雙鏈dna抗體水平。

圖2.acat1敲除增強cd8t細胞抗腫瘤活性。

a-b.野生型小鼠和acat1^cko小鼠中黑色素瘤生長速度以及小鼠的生存曲線分析。腫瘤生長曲線用two-wayanova統計方法分析，小鼠的生存曲線用log-rank(mantel-cox)統計方法分析；

c-d.野生型和acat1^cko小鼠在注射b16f10黑色素瘤細胞后，在第16天將腫瘤取出，通過流式分析cd8t細胞中cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達，同時對腫瘤浸潤的cd8t細胞進行計數，通過流式檢測cd8/cd4t細胞比比率以及cd8t細胞增殖標志物ki-67的表達；

e.流式檢測腫瘤浸潤cd8t細胞表面免疫檢測點受體pd-1和ctla-4的表達；

f.胞內染色和流式檢測腫瘤浸潤的treg細胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例；

g-h.流式檢測引流淋巴結中cd8t細胞中cd44、ifnγ的表達，同時對cd8t細胞進行計數，通過流式檢測cd8/cd4t細胞比比率；

i-k.黑色素瘤肺轉移模型，在注射黑色素瘤細胞后第20天，檢測肺臟中腫瘤數量，同時繼續記錄剩余小鼠的生存率和生存時間，小鼠的生存曲線用log-rank(mantel-cox)統計方法分析；

l.黑色素瘤肺轉移模型中，蘇木精-伊紅染色觀察腫瘤細胞在肺臟中的浸潤情況；

m.黑色素瘤肺轉移模型中，流式檢測肺臟中cd8t細胞cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達；

n-p.將體外誘導分化成熟的野生型和acat1^ckoot-ictl尾靜脈注射到荷瘤b16f10-ova(b16f10黑色素瘤細胞中表達ovalbumin)的c57bl/6野生型小鼠中，檢測腫瘤的生長以及小鼠的生存率。

圖3.acat抑制劑avasimibe處理增強cd8t細胞抗腫瘤能力。

a.野生型cd8t細胞用avasimibe處理(37℃，6小時，即于rpmi1640完全培養基中加藥后，37℃co2培養箱中培養處理6小時，處理完之后用培養基或pbs離心清洗3次)，隨后通過鋪板抗體α-cd3(5μg/ml)+α-cd28(5μg/ml)刺激24小時，然后胞內染色和流式檢測顆粒酶b，細胞因子ifnγ和tnfα的表達；

b.avasimibe處理ot-ictl(37℃，6小時)處理方式同a,通過檢測ldh的釋放分析ot-ictl對靶細胞el-4的殺傷效率；

c.mts方法檢測avasimibe處理對黑色素瘤細胞b16f10細胞活率的影響；

d-f.avasimibe處理b16f10黑色素瘤荷瘤的c57bl/6野生型小鼠，檢測腫瘤生長曲線和小鼠生存率；

g-h.在注射腫瘤后第18天將腫瘤取出，通過流式分析腫瘤浸潤的cd8t細胞中cd44、顆粒酶b、ifnγ和tnfα的表達，同時對腫瘤浸潤的cd8t細胞進行計數，通過流式檢測cd8/cd4t細胞比比率以及cd8t細胞增殖標志物ki-67的表達；

i.流式檢測腫瘤浸潤cd8t細胞表面免疫檢測點受體pd-1和ctla-4的表達；

j.胞內染色和流式檢測腫瘤浸潤的treg細胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例；

k.流式檢測腫瘤組織中mdsc細胞(gr1⁺cd11b⁺cd45⁺)的比例。

圖4.avasimibe處理上調cd8t細胞質膜上膽固醇水平，促進tcr微簇和免疫突觸形成，增強tcr信號通路的活化。

a-b.avasimibe處理cd8t細胞(37℃，6小時)，filipiniii染色檢測cd8t細胞游離膽 固醇的分布；細胞質膜膽固醇的相對定量結果通過leicalasaf軟件處理獲取；

c.avasimibe處理cd8t細胞后，通過storm對cd8t細胞質膜表面tcr的分布進行分析；

d-e.對圖c獲得的成像信息進行ripley’kfunction分析，r代表tcr微簇的大小，l(r)-r代表tcr微簇形成的程度；

f-g.avasimibe處理cd8t細胞后，通過tirfm檢測cd8t細胞免疫突觸的形成；

h.avasimibe處理ot-ictl細胞后，用2μg/mlα-cd3和2μg/mlα-cd28激活ctl，然后western-blotting檢測tcr近端信號通路和下游信號通路的活化情況；

i-k.storm對腫瘤浸潤的cd8t細胞進行成像以及ripley’kfunction分析。

圖5.acat1基因敲除和avasimibe抑制小鼠llc肺癌發展進程。

a-c.llc肺癌在野生型小鼠和acat1基因敲除小鼠中的進程，小鼠生存曲線用log-rank(mantel-cox)統計方法進行分析；

d-g.avasimibe處理llc(lewislungcarcinoma)肺癌荷瘤的小鼠，評估avasimibe在治療小鼠肺癌中的功效，給藥路徑、給藥天數及每日劑量見圖d，小鼠生存曲線用log-rank(mantel-cox)統計方法進行分析；

圖6.acat抑制劑增強人pbmc中cd8⁺t細胞的效應功能

*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖7.avasimibe與化療藥dacarbazine聯合用藥抑制小鼠黑色素瘤發展進程。

a-c.對b16f10黑色素瘤荷瘤的野生型c57bl/6小鼠進行avasimibe與化療藥dacarbazine聯合用藥治療，檢測腫瘤生長曲線和小鼠生存率，比較聯合治療與單一療法效果的差異，給藥路徑、給藥天數及每日劑量見圖a，小鼠生存曲線用log-rank(mantel-cox)統計方法進行分析。

i.g.-灌胃給藥，i.p.-腹腔注射給藥

具體實施方式

本發明經研究發現，抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1可以增強cd8t細胞對腫瘤的殺傷活性。因此認為酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑可用作腫瘤免疫治療劑與其他腫瘤免疫治療劑聯合使用以提高腫瘤免疫治療療效。進一步的研究表明，在與抗pd-l1抗體聯合用藥中，兩者可以起到協同效果，可進一步增強對于腫瘤的抑制。

酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat

酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat是調控細胞內膽固醇代謝的平衡的一種酶，在生物體內催化膽固醇與長鏈脂肪酸形成膽固醇酯。在哺乳動物細胞中發現兩種同工異構酶acat1和acat2。acat1選擇性地在組織與細胞中表達，與細胞內膽固醇代謝平衡有關；而acat2則廣泛存在于肝臟、胃腸道等細胞中，主要參與飲食中膽固醇的吸收和載脂蛋白的裝配。

酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑

是指對于酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1具有抑制效果的化合物。對于酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1活性，或者抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因轉錄或表達。

所述的酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑包括但不限于為sirna、shrna、抗體、小分子化合物。

所述酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑可以是對acat1與acat2沒有選擇性的acat抑制劑，已知的例如purpactins，manassantina,diphenylpyridazinederivatives,glisoprenina，cp113,818,avasimibe,pactimibe等，也可以是對acat1具有選擇性抑制的抑制劑如k604等。

抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1活性是指使酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1酶活力下降。優選的，相比抑制前，酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1酶活力降低至少10％，較佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因轉錄或表達是指：使酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因不轉錄，或降低酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因的轉錄活性，或者使酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因不表達，或降低酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因的表達活性。

本領域技術人員可以使用常規方法對acat1基因轉錄或表達進行調節，如基因敲除、同源重組，干擾rna等。

酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1的基因轉錄或表達的抑制可以通過pcr及westernblot檢測表達量驗證。

優選地，與野生型相比，acat1基因轉錄或表達降低至少10％，較佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地acat1基因完全沒有表達。

小分子化合物

本發明中指由幾個或幾十個原子組成，分子質量在1000以下的化合物。

avasimibe(ci-1011)

化學名稱：2,6-diisopropylphenyl2-(2,4,6-triisopropylphenyl)acetylsulfamate

分子式：c29h43no4s

ic50:acat,3.3μm；cyp2c9,2.9μm；cyp1a2,13.9μm；cyp2c19,26.5μm

casno.166518-60-1

結構式如下

k604

化學名稱：

2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-n-[2,4-bis(methylthio)-6-methyl-3-pyridyl]acetamide

ic50:acat1,0.45μm；acat2,102.85μm

結構式：

在文獻ikenoya,m.etal.aselectiveacat-1inhibitor,k-604,suppressesfattystreaklesionsinfat-fedhamsterswithoutaffectingplasmacholesterollevels..atherosclerosis191,290-297,

doi:10.1016/j.atherosclerosis.2006.05.048(2007)中公開。

cp113,818

化學名稱：(-)-n-(2,4-bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoicamide

ic50:17-75nm

結構式：

在文獻hutter-paier,b.etal.theacatinhibitorcp-113,818markedllyreducesamyloidpathologyinamousemodelofalzheimer'sdisease.neuron44,227-238,

doi:10.1016/j.neuron.2004.08.043(2004)中公開

u18666a

casno.3039-71-2

ci976

化學名稱：2,2-dimethyl-n-(2,4,6-trimethoxyphenyl)dodecanamide

分子式：c23h39no4

casno.114289-47-3；

ic50:soat1:ic50＝73nm(human)；acylcoenzymea:cholesterolacyltransferase1:ic50＝73nm(rat)；sterolo-acyltransferase,soat:ic50＝110nm(rat)；foamcellformation:ic50＝3.8μm(ratperitonealmacrophages)；golgi-associatedlpatactivity:ic50＝15μm

結構式

tmp-153

分子式：c24h18cif2n3o

casno.128831-46-9

ic50:cholesterolacyltransferase(acat):ic50＝5-10nm；acylcoenzymea:cholesterolacyltransferase1:ic50＝5.8nm(rattusnorvegicus)

ym750

分子式：c31h36n2o

casno.138046-43-2

ic50:0.18μm

geri-bp002-a

化學名稱：2,2'-methylenebis(6-tert-butyl-4-methyl-phenol)；

分子式c23h32o2

casno.119-47-1

sandoz58-035

化學名稱：

3-[decyldimethylsilyl]-n-[2-(4-methylphenyl)-1-phenethyl]propanamiide

sa58-035

分子式：c30h47nosi

casno.78934-83-5

ic50:acat1,0.3μm(rat)

vulm1457

化學名稱：

n-[2,6-bis(1-methylethyl)phenyl]-n”-[4-[(4-nitrophenyl)thio]phenyl]urea；

分子式：c25h27n3o3s

casno.228544-65-8

ctl細胞

ctl細胞即為細胞毒性t淋巴細胞(cytotoxiclymphocyte,ctl)，是一種終末分化的cd8t細胞，可以通過其tcr識別相應抗原并對表達相應抗原的腫瘤細胞或者受感染的細胞進行殺傷。

cd8t細胞

cd8t細胞即為cd8陽性t細胞。cd8(群集分化8)是作為協同受體的t細胞受體(tcr)的跨膜糖蛋白。

聯合治療藥物組合和施用方法

所述聯合治療藥物組合可以是以下形式中的任意一種：

一)將酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和達卡巴嗪分別制成獨立的制劑，制劑的劑型可相同或不同，給藥途徑亦可相同或不同。使用時，可兩種藥同時使用，也可兩種藥先后使用。先后給藥時，應當在先用藥物仍對機體有效的期間內向機體施加其他藥物。

二)將酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和達卡巴嗪配置成復方制劑。在將酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和達卡巴嗪采用相同給藥途徑給藥并同時施加時，可采用將兩者配置成復方制劑的形式。

達卡巴嗪常用的用藥方法為靜脈注射、靜脈滴注或動脈灌注。其用法用量可參考現有技術。

小分子化合物常用的用藥方法可以是胃腸道給藥或者是胃腸外給藥。sirna、shrna、抗體則一般采用胃腸外給藥。可以是局部給藥亦可以為全身給藥。avasimibe為已知用于治療動脈粥樣硬化以及阿爾茨海默病的藥物，其用法用量可參考現有技術，其他酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑的用法用量亦可參考avasimibe。

可以同步的或順序地給予有效量的酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑和有效量的達卡巴嗪。在部分實施例中，酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑采用胃腸道給藥劑型，達卡巴嗪采用胃腸外給藥劑型。或者，酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑及達卡巴嗪均采用胃腸外給藥劑型。或者，酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑對離體的ctl細胞進行處理，并在體外擴大培養ctl細胞后回輸機體，而達卡巴嗪直接對機體采用胃腸外給藥。使用時，可兩種藥同時使用，也可兩種藥先后使用。先后給藥時，應當在先用藥物仍對生物體有效的期間內向生物體施加其他藥物。

以酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑為主要活性成分或主要活性成分之一制備藥物。通常，藥物中除了有效成分外，根據不同劑型的需要，還會包括一種或多種藥學上可接受的載體或輔料。

“藥學上可接受的”是指當分子本體和組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。

“藥學上可接受的載體或輔料”應當與酰基輔酶a：膽固醇酰基轉移酶acat1抑制劑相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。可作為藥學上可接受的載體或輔料的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末； 麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。這些物質根據需要用于幫助配方的穩定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產生可接受的口感或氣味。

本發明中，除非特別說明，藥物劑型并無特別限定，可以被制成針劑、口服液、片劑、膠囊、滴丸、噴劑等劑型，可通過常規方法進行制備。藥物劑型的選擇應與給藥方式相匹配。

在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。

除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組dna技術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

1.材料和試劑

細胞培養基(dmem)、胎牛血清(fbs)購自lifetechnologies；filipiniii,mβcd,mβcd-cholesterol購自sigma；α-cd3和α-cd28購自biolegend；流式分析抗體α-mcd4(rm4-5), α-mcd8(53-6.7),α-mcd3ε(145-2c11),α-ifn-γ(xmg1.2),α-tnf-α(mp6-xt22),α-granzymeb(ngzb),α-cd44(im7),α-cd69(h1.2f3),α-pd-1(j43),α-ctla-4(uc10-4b9),α-ki67(16a8),α-foxp3(fjk-16s),α-gr1(rb6-8c5),α-cd11b(m1/70)和α-cd45(30-f11)購自ebioscience；western-blotting抗體α-pcd3ζ購自abcam,α-cd3ζ購自santacruze,α-pzap70,α-zap70,α-plat,α-lat,α-perk1/2和α-erk1/2購自cellsignaling；mts檢測試劑盒購自promega；avasimibe購自selleck；k604由中科院上海藥物研究所合成；cp113,818由pierrefabre提供；b16f10細胞系和llc(lewislungcarcinoma)細胞系最初來源于atcc,由中國科學院細胞庫提供

2.實驗動物

c57bl/6小鼠購自slac；ot-itcr轉基因小鼠來自jackson實驗室；cd4^cre轉基因小鼠由中國科學院生物化學與細胞生物研究所劉小龍研究組提供(jaxmice亦有該小鼠提供)；acat1^flox/flox來自ingeneiouslabs，該試驗動物在acat1基因的14號外顯子毗鄰的兩個內含子上分別有一個loxp位點，該外顯子編碼有his460位點，該位點是acat1的酶活所必需的，acat1^flox/flox可采用現有常規技術構建。實驗中所有的動物都飼養在spf設施中。

3.t細胞分離，培養和流式檢測

t細胞來自小鼠脾臟和淋巴結，通過cd8或者cd4陰性篩選磁珠(stemcell)進行分離得到。對于腫瘤浸潤t細胞的分離，小鼠在注射腫瘤后14-18天，將腫瘤取出，剪成1-2mm碎片，膠原酶iv(sigma)消化1小時，然后通過40–70％percoll(ge)密度梯度離心得到腫瘤浸潤白細胞群。為進一步得到腫瘤浸潤的cd8t細胞，進一步用cd8陽性磁珠分選試劑盒(stemcell)進行分離。

分離得到的細胞用含50μmβ-巰基乙醇的rpmi1640完全培養基在37℃co2培養箱培養。為進一步分析t細胞的功能表型，針對細胞表面標志物如cd8,cd44,cd69，細胞離心后直接用percp-α-cd8，fitc-α-cd44，pe-α-cd69進行染色，然后流式檢測；而針對胞內顆粒酶和細胞因子的檢測，分離到的細胞繼續用1μmionomycin和50ng/mlpma刺激培養4個小時，在培養過程中加入5μg/mlbfa，以阻斷顆粒酶和細胞因子向胞外分泌。刺激結束后，4％多聚甲醛(pfa)室溫固定10分鐘，然后胞內染色檢測胞內顆粒酶和細胞因子的水平。

4.膽固醇定量

a.filipin染色和激光共聚焦成像技術對細胞質膜膽固醇進行相對定量

filipiniii溶于甲醇中至5mg/ml。t細胞用4％pfa固定，然后用50μg/mlfilipiniii于4℃染色30分鐘，然后pbs洗5次以去除游離filipin。成像圖片由leicasp8激光共聚焦顯微成像系統獲取，相對定量結果由leicalasaf軟件分析得到。

b.基于膽固醇氧化的膽固醇定量方法

細胞經0.1％戊二醛固定15分鐘后，pbs洗3次，然后用2u/ml膽固醇氧化酶室溫處理15分鐘以氧化細胞質膜上游離膽固醇；氧化反應結束后pbs洗3次以去除殘留的膽固醇氧化酶，細胞內未被氧化的游離膽固醇用甲醇/氯仿(v:v＝1:2)提取，然后用amplexredcholesterol檢測試劑盒(lifetechnology)對游離膽固醇進行定量。細胞質膜膽固醇的含量由未被氧化酶處理的樣品膽固醇含量減去氧化酶處理過的樣品膽固醇含量得到。

5.ova抗原激活ot-icd8t細胞

將c57bl/6小鼠脾臟細胞中的t細胞用t細胞陽性磁珠分選試劑盒(miltenyibiotech)去除，然后分別遞呈ova抗原ova257-264(siinfekl，簡稱n4)，及突變體sainfekl(簡稱a2)，siitfekl(簡稱t4)，siigfekl(簡稱g4)以及自身抗原rtytyekl(簡稱catnb)和陽性選擇抗原siirfekl(簡稱r4)作為抗原遞呈細胞(apc)。具體的，為分別將ova抗原ova257-264，a2，t4，g4，r4和自身抗原catnb與前述處理后的小鼠脾臟細胞一起在37℃孵育以得到抗原呈遞細胞，同時；將陰性磁珠分選得到的ot-icd8t細胞與抗原遞呈細胞共同培養(1：5)24小時，在培養的最后4小時加入5μg/mlbfa(是布雷菲德菌素a)，以阻止細胞因子向胞外分泌，最后通過胞內染色和流式檢測細胞因子的表達。

6.檢測cd8t細胞(ctl)的細胞殺傷能力。

分離ot-i轉基因小鼠的脾臟，紅細胞裂解液去除紅細胞后用5nmova257-264(n4)刺激，并在培養基中加入10ng/mlil-2，3天后換液補加il-2并繼續培養2天得到分化成熟的殺傷性cd8t細胞(ctl)。將el-4小鼠淋巴瘤細胞分別與2nm抗原肽ova257-264及其突變體a2，t4，g4，r4和自身抗原catnb在37℃孵育30分鐘以遞呈相關抗原，pbs洗3次后將遞呈抗原的el-4細胞和ctl重懸在無酚紅rpmi1640培養基(含2％fbs)中，然后以1：1，1：2，1：5比例混合(el-4細胞數量為1×10⁵)加入96孔板中，200g離心2分鐘。37℃co2培養箱培養4小時，200g離心5分鐘，取培養上清液，通過cytotox96non-radioactivecytotoxicity試劑盒(promega)檢測培養基中乳酸脫氫酶ldh的釋放以計算ctl對靶細胞的殺傷效率。

7.小鼠b16黑色素瘤模型

b16f10黑色素瘤細胞用胰酶消化后，pbs洗3次后過40μm濾網，計數用pbs稀釋至2×10⁶/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左側(100μl體積)，從第10天開始，游標卡尺 測量腫瘤大小，每兩天測一次，腫瘤大小＝長度×寬度。當腫瘤其最長軸超過20mm時，將小鼠安樂死，并記錄死亡時間點。

8.小鼠黑色素瘤t細胞過繼治療

表達雞卵清蛋白ovalbumin的b16f10-ova黑色素瘤細胞(ref)(可參考文獻：yangjetal.,kuper-typeimmunologicalsynapsecharacteristicsdonotpredictanti-braintumorcytolytict-cellfunctioninvivo.procnatlacadsciusa.2010.197(10):4716-21；獲zhoupetal.,invivodiscoveryofimmunotherapytargetsinthetumourmicroenvironment.nature.2014,506(7486):52-7獲得)用胰酶消化后，pbs洗3次后過40μm濾網，計數用pbs稀釋至2×10⁶/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左側(100μl)。在注射腫瘤細胞后第10天，將成瘤且腫瘤大小一致的小鼠隨機分成3組，以尾靜脈注射(i.v.)的方式分別注射200ulpbs，野生型ot-ictl和acat1基因敲除的ot-ictl(1.5×10⁶)，3天后開始測量腫瘤大小，每兩天測一次。當腫瘤其最長軸超過20mm時，將小鼠安樂死，并記錄死亡時間點。

acat1基因敲除的ot-i小鼠的獲得：cd4^cre小鼠與acat1^flox/flox小鼠交配獲得cd4^cre-acat1^flox/flox,然后與otitcr轉基因小鼠交配，最終獲得ot-i-cd4^cre-acat1^flox/flox小鼠和相應的對照小鼠ot-i-^e-acat1^flox/flox小鼠。

ctl的誘導方法是：取野生型或acat1基因敲除的oti小鼠脾臟，分別用10nm的ova257-264(n4)肽段刺激，并提供10ng/mlil-2，刺激2天后，在第3天換無n4肽段的培養基(含10ng/mlil-2)繼續培養2天即可獲得成熟的ctl。

9.小鼠llc肺癌模型

llc(lewislungcarcinoma)肺癌細胞用胰酶消化后，pbs洗3次后過40μm濾網，計數用pbs稀釋至10⁷/ml，然后尾靜脈注射(i.v.)到8-10周雄鼠體內(200μl體積)。在注射腫瘤細胞后第11天，將荷瘤小鼠隨機分成2組，以腹腔注射(i.p.)的方式給小鼠注射avasimibe，劑量為15mg/kg，3天注射一次，連續給藥9次。在注射腫瘤細胞后7周，取部分小鼠的肺臟，對腫瘤斑點進行計數，以評估腫瘤治療效果，同時記錄剩余小鼠的死亡時間點。

10.超高分辨率隨機光學重構顯微鏡storm(super-resolutionstochasticalopticalreconstructionmicroscopy)檢測細胞質膜上tcr(抗原受體)的分布。

超高分辨率隨機光學重構顯微鏡storm成像在nikonn-storm成像系統上進行，該系統配有eclipseti-e電動相差顯微鏡，apochromat100倍tirf油鏡和emccd。熒光染料選用alexa647，通過647nm連續可見光激光器(200mw)和450nm二極管激光器激發熒光染料。成像時tirf角度參數在3900-4000，以保證樣品成像深度在1μm左右。cd8t細胞和激 活的cd8t細胞(10μg/mlα-cd3抗體37℃刺激10分鐘)通過多聚賴氨酸貼在ibidi35mmμ-dish上，然后4％pfa固定；pbs洗3次后用2μg/mlalexa647-α-cd34℃標記2小時。成像前，將pbs替換成成像緩沖液(tbs，含100mmmea)。成像速度保持在90-95幀/秒，重構的圖像用niselementsar獲取，圖像信息由20,000-25,000幀圖片組成。

為了分析tcr在質膜上的成簇情況，對圖片中tcr微簇的位置信息用ripley’skfunction和matlab分析，l(r)-r值代表在一定半徑(r)內分子聚集的概率，而l(r)-r最大值對應的r即分析選定區域內tcr微簇的半徑。

11.全內反射熒光顯微成像tirfm(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy，)方法動態檢測t細胞免疫突觸形成過程。

dopc(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)與生物素標記的dope(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-cap-biotin)以25:1的摩爾比混合，超聲形成脂質體。使用no.1.5h厚度玻璃底的細胞培養皿，食人魚酸液處理玻璃底表面并用雙蒸水清洗干凈。用濃度0.1mm的生物素標記的脂質體孵育玻片20分鐘。pbs充分清洗后，用鏈霉親和素(streptavidin)孵育30分鐘。pbs充分清洗后，用生物素標記的小鼠cd3ε抗體(bionylatedα-mcd3ε,145-2c11)孵育30分鐘。pbs充分清洗后，用1％酪蛋白封閉20分鐘。pbs充分清洗，平面脂雙分子層準備完畢。

α-mtcrβ抗體(biolegend)進行熒光染料標記(alexafluor568nhsester，lifetechnologies),經脫鹽柱脫鹽后使用papain蛋白酶酶切(piercefabmicropreparationkit,thermoscientific),最后經proteina柱分離(proteinaplusspincolumn,thermoscientific)得到alexa568-α-mtcrβ-fab。

新鮮分離的小鼠脾臟淋巴細胞用alexa568-α-mtcrβ-fab和fitc-α-mcd8a(ebioscience)冰上染色，pbs清洗2次。重懸的細胞加入如上所述的鋪有平面脂雙分子層的培養皿，置于37℃加熱臺，以3秒每幀的速度拍攝，進行活細胞全內反射熒光顯微鏡成像。或者重懸的細胞加入上文所述鋪有平面脂雙分子層的培養皿，置于37℃培養箱，刺激一定時間后用4％pfa固定，全內反射熒光顯微鏡成像。fitc陽性的cd8t細胞用imageproplussoftware(mediacybernetics)、imagej(nih)和matlab(mathworks)軟件經行數據分析。

12.mts方法檢測腫瘤細胞活率。

b16f10細胞(5×10³)重懸于100μl含有1μmavasimibe或dmso對照的培養基中。37℃培養24、48、或72小時。加入20μlmts試劑(promega)，孵育1-3小時后，測量490nm吸光度。 490nm處的吸光值與培養中的活細胞數成正比。avasimibe對細胞活性的影響通過以dmso處理的細胞為對照組進行歸一化處理得到，設定dmso處理組的細胞活性為1。

13.數據統計分析

除在圖釋中特別注明外，本文所有數據統計都是用graphpadprism(graphpadsoftware,inc.)進行統計分析，分析方法采用two-tailedunpairedstudent’st-test；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns：無顯著差異(nosignificantdifference)。

14.t細胞特異性敲除acat1小鼠的構建及acat1^ckocd8t、acat1^ckocd4t細胞的獲得

將acat1^flox/flox小鼠與cd4^cre小鼠交配，獲得的小鼠經pcr及westernblot檢測表達量驗證為t細胞特異性敲除acat1小鼠(cd4^cre-acat1^flox/flox,簡稱acat1^cko)。

acat1^ckocd8t細胞的獲得：采用cd8磁珠分選得到(分選試劑盒來自stemcell)

acat1^ckocd4t細胞的獲得：采用cd4磁珠分選得到(分選試劑盒來自stemcell)

15.cd8t細胞活化方法

通過磁珠分選得到的新鮮t細胞，重懸于rpmi1640完全培養基中，α-cd3(5μg/ml)和α-cd28(5μg/ml)鋪板刺激,37℃co2培養箱中培養刺激24小時,為進一步用胞內染色-流式細胞術檢測細胞因子的表達，在最后4小時補加5mg/mlbrefeldina以阻斷細胞因子向細胞外分泌。

實施例1acat1基因敲除不會引發cd8t細胞對自身抗原產生反應和自身免疫

本實施例的目的是為了研究去除acat1功能后cd8t細胞獲得增強的效應功能是否會使得cd8t細胞對自身抗原產生反應從而誘發自身免疫病。為了研究這一點，將acat1^cko小鼠進一步與ot-itcr轉基因小鼠(jaxmice)進行交配，獲得ot-i背景的acat1特異性基因敲除小鼠(ot-iacat1^cko)和相應的對照小鼠(ot-i)。ot-i轉基因小鼠的絕大部分t細胞為ot-icd8t細胞，其tcr特異性識別h2k^b遞呈的ovalbumin(ova257-264)抗原(簡稱n4)，并產生相應的cd8t細胞免疫應答反應；同時ot-itcr除了識別其野生型抗原(n4)外，也可識別一系列的ova突變體(a2,t4,g4,r4)，并產生相應的強弱免疫應答反應。試驗發現，acat1缺陷除了能促進ot-icd8t細胞對強弱抗原的免疫應答反應，具體表現為細胞因子ifnγ的分泌量增加以及對靶細胞的殺傷效應(圖1a,b)。但是acat1缺陷不會引起ot-icd8t細胞對自身抗原catnb(β-catenin片段，可以被h2k^b呈遞)以及類自身抗原r4產生免疫應答。這個結果表明acat1基因敲除不影響t細胞對抗原親和力(affinity)識別能力。為進一步驗證acat1基因敲除后小鼠自身免疫情況，用elisa方法檢測了小鼠血 清中細胞因子ifnγ和自身抗體抗雙鏈dna抗體。結果顯示，與對照小鼠相比，這兩項指標沒有任何改變(圖1c)，表明acat1基因敲除并不引起自身免疫反應，進一步表明acat1作為腫瘤免疫治療靶點的安全性。

實施例2利用三種黑色素瘤模型研究acat1基因敲除促進cd8t細胞的抗腫瘤活性

免疫治療是當前治療腫瘤的熱點，而cd8t細胞對腫瘤細胞的殺傷能力直接關系到腫瘤免疫治療的效果。為了驗證acat1敲除對cd8t細胞的抗腫瘤能力的影響，本實施例首先建立了皮下黑色素瘤模型，在acat1^cko小鼠和野生型小鼠中皮下注射b16f10黑色素瘤細胞誘導黑色素瘤，實驗發現acat1^cko小鼠黑色素瘤的進程被顯著延緩，表現為腫瘤生長更慢，小鼠的生存率和生存期更長(圖2.a,b)。對荷瘤小鼠的t細胞的表型進行分析，發現在acat1^cko小鼠中，腫瘤浸潤的cd8t細胞活性更強，表現為acat1^cko小鼠腫瘤浸潤cd8t細胞中，cd44高表達的效應細胞更多，表達顆粒酶b和細胞因子ifnγ和tnfα的比例也更高；而且acat1^cko小鼠腫瘤浸潤cd8t細胞的數量、cd8/cd4細胞的比例也要高于野生型、細胞增殖的標志物ki-67的表達水平也更高(圖2.c,d)。免疫檢測點受體如pd-1和ctla-4目前是腫瘤免疫治療的熱門靶點，實驗也檢測了腫瘤浸潤的cd8t細胞表面pd-1和ctla-4的表達水平，發現其在acat1^cko和野生型小鼠中沒有明顯差異(圖2.e)；同時實驗也檢測了腫瘤中cd4t細胞中treg細胞(cd4⁺foxp3⁺)的比例,發現acat1敲除并不改變treg細胞在cd4t細胞中的比例(圖2.f)。以上結果表明acat1敲除使cd8t細胞的抗腫瘤效應功能增強。

為了進一步驗證cd8t細胞在該腫瘤模型中的應答反應受acat1的調控，實驗在皮下注射b16f10黑色素瘤細胞后第7天，將acat1^cko和野生型小鼠的引流淋巴結(draininglymphnode)取出，分析其中t細胞的表型。實驗發現acat1^cko小鼠引流淋巴結中的cd8t細胞cd44水平和細胞因子ifnγ的表達上升(圖2.g)，而且cd8t細胞的數量以及cd8/cd4的比率也顯著升高(圖2.h)，表明acat1缺陷促進cd8t細胞的初始免疫應答反應。

相比較與皮下實體瘤，轉移型腫瘤的進程更為復雜，其治療更為艱難。為進一步檢測acat1缺陷是否影響cd8t細胞對轉移瘤的免疫應答反應，實驗建立了黑色素瘤肺轉移小鼠模型，向acat1^cko和野生型小鼠尾靜脈注射b16f10黑色素瘤細胞，然后檢測肺臟中黑色素瘤的發展進程。實驗發現在acat1^cko小鼠中，與野生型對照小鼠相比，其肺臟腫瘤數量明顯減少，而且小鼠的生存率和生存期更長(圖2.i-k)。通過蘇木精-伊紅(h&e)對肺臟組織進行染色，發現acat1基因敲除后，黑色素瘤在肺臟中的浸潤明顯減弱(圖2.l)。對肺臟t 細胞的表型進行分析，也發現acat1^cko小鼠cd8t細胞中cd44高表達的效應細胞更多，表達顆粒酶b和細胞因子ifnγ和tnfα的比例也更高(圖2.m)。這些結果表明acat1缺陷增強cd8t細胞在非轉移和轉移型腫瘤中的抗腫瘤免疫應答效應。

由于acat1^cko小鼠中所有的t細胞都缺失acat1，為了驗證acat1基因敲除是對腫瘤浸潤的cd8t細胞而非cd4t細胞的功能的影響而獲得更強抗腫瘤作用，在野生型c57小鼠皮下注射b16f10-ova黑色素瘤細胞，該細胞表達ovalbumin，可以被黑色素瘤細胞的h2kb遞呈在細胞表面，從而被ot-icd8t細胞識別。在野生型小鼠成功誘導黑色素瘤后，在注射腫瘤后第10天以尾靜脈注射的方式，將來自acat1^cko小鼠和野生型小鼠的ot-ictl注射到荷瘤野生型小鼠體內，然后監測腫瘤生長并記錄小鼠的生存情況(圖2.n)，結果表明，注射了acat1^ckoot-ictl的實驗組腫瘤生長比注射了野生型ot-ictl的對照組更慢，而且小鼠的生存時間更長(圖2.o,p)，進一步表明acat1特異性敲除的cd8t細胞有更好的抗腫瘤作用。

實施例3acat抑制劑avasimibe增強cd8t細胞的抗腫瘤功能。

本實施例目的是進一步驗證acat1抑制劑在腫瘤免疫治療中的應用。acat1作為用作治療動脈粥樣硬化的靶點，目前已有一系列小分子藥物在進行動物和臨床實驗。avasimibe是其中一種，目前多次臨床實驗已經驗證了avasimibe在的安全性。因此選用avasimibe，驗證acat1作為腫瘤免疫治療靶點的可能性。體外實驗表明，avasimibe與其他acat抑制劑如cp113,818和k604一樣，可以促進cd8t細胞顆粒酶b的釋放和細胞因子ifnγ和tnfα的表達(圖3.a)。體外殺傷實驗也表明avasimibe增強ctl的靶細胞殺傷能力，且呈劑量效應(圖3.b)。實驗進一步在小鼠黑色素瘤模型中驗證avasimibe的作用，通過對黑色素瘤荷瘤野生型小鼠進行腹腔注射給藥(15mg/kg)處理，與對照小鼠相比，avasimibe給藥的小鼠腫瘤生長減慢，小鼠的生存時間也顯著延長(圖3.d-f)。為了驗證avasimibe不是通過直接抑制腫瘤細胞的生長，在體外實驗中用avasimibe處理b16f10黑色素瘤細胞，發現avasimibe處理不影響b16f10細胞的活性(圖3.c)。對小鼠腫瘤浸潤的免疫細胞進行分析發現，avasimibe給藥的小鼠中：其腫瘤浸潤的cd8t細胞活性更高，表現為cd8t細胞表面活化標記cd44的表達比例更高，而且表達顆粒酶b，細胞因子ifnγ和tnfα的細胞比例也更高。對小鼠腫瘤浸潤的t細胞進行計數，發現avasimibe給藥組的腫瘤浸潤cd8t細胞數量更多，且cd8/cd4比率更高。另外avasimibe給藥組腫瘤浸潤cd8t細胞中的細胞增殖標記物ki-67的表達水平也更高(圖3.g-h)。考慮到腫瘤微環境的免疫抑制效應，實驗也檢測了cd8t細 胞上的免疫抑制受體pd-1和ctla-4的表達水平，發現avasimibe給藥并未改變這些免疫檢測點受體的表達(圖3.i)。

腫瘤微環境中還存在有一些抑制型的免疫細胞如treg(regulatorytcell)和mdsc(myeloid-derivedsuppressorcell)，這些細胞通過抑制cd8t細胞等腫瘤殺傷細胞的活性，在腫瘤的發展進程中起著關鍵的作用。因此實驗進一步檢測了腫瘤組織中treg和mdsc的比例，avasimibe給藥后，treg(cd4⁺foxp3⁺)細胞在cd4t細胞中的比例沒有明顯改變，而mdsc(gr1⁺cd11b⁺cd45⁺)在cd45⁺免疫細胞中的比例有較輕微的降低(圖3.j，k)，考慮到avasimibe給藥組的腫瘤組織中cd8t細胞的數量明顯上升，mdsc在cd45⁺細胞中的比例降低可能是由于cd8t細胞在cd45⁺細胞中的比例上升所致(圖3.h)。這些證據表明，acat抑制劑avasimibe可以通過特異性上調cd8t細胞殺傷性效應而在腫瘤治療中起作用。

實施例4avasimibe通過抑制acat1促進cd8t細胞的抗腫瘤活性

本實施例的目的是驗證avasimibe是否是通過抑制acat1發揮其腫瘤免疫能力。為了驗證這一點，在體外用avasimibe對cd8t細胞進行處理，檢測其細胞質膜膽固醇水平的變化。通過filipiniii對細胞進行染色，發現avasimibe處理后，cd8t細胞質膜游離膽固醇水平明顯上升(圖4.a,b)。通過storm對cd8t細胞表面tcr的定位進行分析發現，avasimibe處理促進tcr微簇的形成(圖4.c-e)；通過tirfm對t細胞活化過程中免疫突觸的形成進行分析，也表明avasimibe處理促進cd8t細胞免疫突觸的形成(圖4.f,g)。進一步通過western-blotting方法檢測avasimibe處理后tcr信號通路的活化情況，結果也表明avasimibe處理增強tcr信號通路的活化(圖4.h)。這些結果與acat1敲除的cd8t細胞的表現一致。同時，為進一步在動物體內驗證該機制，實驗從avasimibe給藥的荷瘤小鼠的腫瘤中分離腫瘤浸潤的cd8t細胞，通過storm對腫瘤浸潤的cd8t細胞上tcr的分布進行成像分析，發現avasimibe處理(于rpmi1640完全培養基中加藥后，37℃co2培養箱中培養處理6小時，處理完之后用培養基或pbs離心清洗3次)后，腫瘤浸潤的cd8t細胞表面tcr微簇更大(圖4.i-k)。這些證據表明avasimibe確實是通過抑制acat1促進cd8t細胞的活化，從而增強其抗腫瘤活性。

實施例5avasimibe在小鼠肺癌模型中的功效

本實施例的目的為進一步驗證acat1作為腫瘤免疫治療靶點的有效性。實驗建立了小鼠llc(lewislungcarcinoma)肺癌模型，檢測llc在野生型小鼠和acat1基因敲除小鼠中 肺癌發展進程，結果發現t細胞中acat1基因敲除顯著抑制腫瘤的生長，荷瘤小鼠的生存期也明顯長于對照的野生型小鼠(圖5.a-c)。為了驗證acat1抑制劑avasimibe對llc肺癌的治療效果，進一步對造模成功的小鼠進行avasimibe給藥，結果發現avasimibe在治療小鼠肺癌上也有一定的療效，表現為腫瘤細胞數量較對照組少，小鼠的生存時間延長(圖5.d-g)。

實施例6.acat抑制劑增強人pbmc中cd8⁺t細胞的效應功能

本試驗的目的是驗證acat1作為藥物靶點在臨床上使用的潛在價值，在人cd8t細胞中分別用acat抑制劑avasimibe和cp113,818抑制acat的活性，然后通過抗體交聯的方式激活cd8t細胞，通過流式細胞術檢測cd8t細胞細胞因子ifnγ和tnfα的表達。

試驗方法：通過ficoll從健康志愿者體內獲得的外周血中分離pbmc，然后用5μg/mlpha刺激獲得cd8⁺殺傷性t細胞。3天后換成不含pha的培養液繼續培養24小時，以降低本底信號。再使用相應濃度的avasimibe或cp113,818孵育處理12小時，細胞換液并通過鋪板刺激的方式用5μg/mlα-cd3+5μg/mlα-cd28抗體刺激24小時，在最后4小時加入5μg/mlbrefeldina以阻斷細胞因子的分泌，最后通過胞內染色和流式細胞術檢測cd8⁺t細胞中細胞因子ifnγ和tnfα的表達。雙尾非配對t-test用于差異顯著性分析。

試驗結果：acat抑制劑cp113,818和avasimibe均能促進cd8t細胞細胞因子的表達，且具劑量效應，表明acat1作為增強cd8t細胞效應功能的靶點同樣適用于人的cd8t細胞(圖6)。

實施例7avasimibe與dacarbazine(達卡巴嗪)聯合治療小鼠黑色素瘤的功效

本實施例的目的是為了驗證acat1作為免疫治療靶點在與化療藥聯合用藥中的效果。化療是目前治療腫瘤的有效手段之一，dacarbazine(達卡巴嗪)是目前fda批準用于治療轉移型黑色素瘤的化療藥。本實施例在小鼠黑色素瘤模型中，給小鼠dacarbazine和avasimibe聯合用藥，結果表明顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長，而聯合用藥明顯增強avasimibe的抗腫瘤效果(圖7)。

試驗動物分成4組，每組9-13只，具體見圖7b,c，n值即小鼠數量，經統計分析，組之間的差異顯著性即p值見圖7b,c。

以上的實施例是為了說明本發明公開的實施方案，并不能理解為對本發明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發明中方法、組合物的變化，在不脫離本發明的范圍和精神的前 提下對本領域內的技術人員來說是顯而易見的。雖然已結合本發明的多種具體優選實施例對本發明進行了具體的描述，但應當理解，本發明不應僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領域內的技術人員來說顯而易見的修改來獲取發明都應包括在本發明的范圍內。