本發(fā)明涉及一種絲素蛋白微納米纖維多孔支架及其制備方法，所制備的材料可應(yīng)用于組織工程、藥物緩釋等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于疾病和事故導(dǎo)致的器官或組織損傷和功能缺失的病人每年都有數(shù)百萬之多，僅美國每年需要800多萬次手術(shù)對這類病人進(jìn)行救治，其經(jīng)濟(jì)花費(fèi)在4000億美元以上。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，通過組織或器官移植來修復(fù)功能損失已經(jīng)被廣泛接受，然而卻面臨著巨大的供體缺口。通過再生醫(yī)學(xué)手段體在體內(nèi)或體外形成組織或器官為受損功能的修復(fù)提供了新的治療方案。其中，組織工程支架材料的選擇及構(gòu)建成為該治療方法的關(guān)鍵之一。

蠶絲蛋白是來源于自然界的天然高分子生物材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性質(zhì)、可控的生物降解性、易加工性，特別是其與膠原同等的生物相容性而成為理想的再生醫(yī)學(xué)支架的原材料。我國是蠶絲的主要生產(chǎn)國，蠶絲產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的70%以上。近年來，蠶絲的研究與應(yīng)用從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域延伸到高新技術(shù)領(lǐng)域，如光電子與生物醫(yī)用材料，特別是作為生物醫(yī)用材料已經(jīng)取得了重要進(jìn)展。

天然蠶絲為纖維狀，而生物醫(yī)用材料要求支架形狀具有多樣性與可塑性。因此，對天然絲素纖維的再生加工是拓寬其應(yīng)用范圍的必要前提。目前，蠶絲蛋白被加工成再生長絲、納米纖維膜、絲素膜、多孔支架、水凝膠等，以滿足組織工程對支架材料形態(tài)及性能的要求。其中，納米纖維材料以其仿生結(jié)構(gòu)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到了廣泛關(guān)注。絲素蛋白納米纖維的制備方法十分有限，目前主要是通過靜電紡絲制備，并取得了預(yù)期的生物學(xué)效果。然而，靜電紡絲加工效率低下，且靜電紡納米纖維為膜片狀，難以提供細(xì)胞與組織生長所需要的三維空間，因此極大地限制了應(yīng)用領(lǐng)域與前景。現(xiàn)有技術(shù)反復(fù)進(jìn)行膜干燥-溶解制備再生絲素蛋白多孔材料，孔壁由納米原纖組成，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)納米結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的黏附與增殖，但該方法的效率低，重復(fù)性差，且納米纖維只是分布在孔壁，并未真正形成納米纖維材料。

天然蠶絲本身即是納米纖維材料的集合體，蠶絲內(nèi)部是有納米原纖組成。在再生的過程中，蠶絲原有的納米原纖結(jié)構(gòu)遭到不可逆的破壞，使得再生絲素蛋白材料喪失原有的納米纖維結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的力學(xué)性能。但是作為一種生物醫(yī)用支架，仿生構(gòu)建具有細(xì)胞外基質(zhì)納米纖維結(jié)構(gòu)（直徑在100nm以下）仍然是一個重要的研究方向。因此有必要研發(fā)一種打開蠶絲原纖間的作用力直接獲得絲素蛋白微納米纖維多孔支架的制備方法，該方法制備的材料不僅具有仿生結(jié)構(gòu)，同時具有優(yōu)良的理化性質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種簡單、易操作的絲素蛋白微納米纖維多孔支架制備方法，及由該方法制備的結(jié)構(gòu)仿生、力學(xué)性能優(yōu)異的絲蛋白多孔材料。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種絲蛋白微納米纖維多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）蠶絲脫膠后，直接浸泡在酸溶液中進(jìn)行溶脹處理,得到溶脹蠶絲；

（2）將溶脹蠶絲置入模具中進(jìn)行冷凍處理，然后進(jìn)行融化處理；

（3）重復(fù)步驟（2）的冷凍處理以及融化處理，最后得到多次冷凍-融化處理的冷凍體；

（4）將步驟（3）得到的冷凍體進(jìn)行冷凍干燥即得到絲蛋白微納米纖維多孔支架。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲、天蠶絲中一種或幾種。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中所述酸為鹽酸、甲酸、乙酸、硫酸、磷酸、氫氟酸中的一種或幾種。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，酸溶液的濃度1～98 wt%。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，溶脹處理的時間為25～35分鐘；本發(fā)明中，酸滲透到蠶絲內(nèi)部，引起蠶絲體積膨脹，原纖間的作用力受到消弱，經(jīng)過多次冷凍-融化循環(huán)打開蠶絲原纖間的作用力直接獲得絲素蛋白微納米纖維，獲得具有仿生結(jié)構(gòu)的生物支架。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，冷凍處理的溫度為酸的冰點(diǎn)溫度，利用大量滲入溶劑的結(jié)冰促使微米級纖維分纖獲得納米纖維。

上述技術(shù)方案中，步驟（3）中，重復(fù)步驟（2）的冷凍處理以及融化處理5～50次；經(jīng)過冷凍處理，甲酸在蠶絲內(nèi)部發(fā)生結(jié)冰固化，進(jìn)一步消弱蠶絲內(nèi)部原纖間的作用力。如此反復(fù)多次，原纖發(fā)生劈裂分開，再經(jīng)冷凍干燥工藝即可形成微納米纖維組成的多孔支架材料，其中微溶的絲蛋白發(fā)揮膠粘穩(wěn)固支架形態(tài)的作用。因蠶絲僅在原纖水平發(fā)生分裂，蠶絲內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu)并未受到破壞，由此形成的絲蛋白材料具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與優(yōu)異的物理力學(xué)性能。

本發(fā)明還公開了按照上述制備方法制備的絲蛋白微納米纖維多孔支架，該支架由10nm～10μm的纖維組成，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為50μm～1mm。

本發(fā)明中，蠶絲不溶解于酸，在酸中發(fā)生溶脹，酸滲透到蠶絲內(nèi)部，引起蠶絲體積膨脹，原纖間的作用力受到消弱。經(jīng)過冷凍處理，酸在蠶絲內(nèi)部發(fā)生結(jié)冰固化，進(jìn)一步消弱蠶絲內(nèi)部原纖間的作用力。如此反復(fù)多次，原纖發(fā)生劈裂分開，再經(jīng)冷凍干燥工藝即可形成微納米纖維組成的多孔支架材料，其中微溶的絲蛋白發(fā)揮膠粘穩(wěn)固支架形態(tài)的作用。因蠶絲僅在原纖水平發(fā)生分裂，蠶絲內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu)并未受到破壞，由此形成的絲蛋白材料具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與優(yōu)異的物理力學(xué)性能，可用于制備細(xì)胞與組織生長材料。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明制備方法簡單、可操控性強(qiáng)，僅利用酸溶脹并結(jié)合多次冷凍-融化處理即可實(shí)現(xiàn)蠶絲分纖制取微納米纖維多孔材料，蠶絲內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu)并未受到破壞，由此形成的絲蛋白材料具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與優(yōu)異的物理力學(xué)性能。

（2）本發(fā)明制備方法無需有機(jī)溶劑后處理工序，所制備的絲素蛋白多孔材料由直徑介于10nm~10μm絲蛋白纖維組成，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一制得的絲素蛋白微納米纖維多孔支架的掃描電鏡圖；

圖2為實(shí)施例二制得的絲素蛋白微納米纖維多孔支架的掃描電鏡圖；

圖3為實(shí)施例三制得的絲素蛋白微納米纖維多孔支架的掃描電鏡圖；

圖4為實(shí)施例四制得的絲素蛋白微納米纖維多孔支架的掃描電鏡圖；

圖5為實(shí)施例五制得的絲素蛋白微納米纖維多孔支架的掃描電鏡圖；

圖6為實(shí)施例五制得的絲素蛋白微納米纖維多孔支架的X-射線衍射譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于0.1mol鹽酸中浸泡30min。

（3）將鹽酸浸泡蠶絲置于-20℃冷凍，然后置于4℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理5次后放入-20℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成絲蛋白多孔支架。

附圖1為上述制得的絲素蛋多孔支架的掃描電鏡圖片。由圖可見多孔支架由未分纖的蠶絲纖維和分纖后的亞微米纖維組成，直徑介于10nm~10μm，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

實(shí)施例二

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于50 wt%氫氟酸中浸泡30min。

（3）將酸浸泡蠶絲置于-40℃冷凍，然后置于4℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理10次后放入-40℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成絲蛋白多孔支架。

附圖2為上述制得的絲素蛋多孔支架的掃描電鏡圖片。由圖可見多孔支架由未分纖的蠶絲纖維和分纖后的亞微米纖維組成，直徑介于10nm~10μm，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

實(shí)施例三

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于98wt%甲酸中浸泡30min。

（3）將酸浸泡蠶絲置于-80℃冷凍，然后置于20℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理20次后放入-20℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成絲蛋白多孔支架。

附圖3為上述制得的絲素蛋多孔支架的掃描電鏡圖片。由圖可見多孔支架由蠶絲微米纖維和納米纖維組成，直徑介于10nm~10μm，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

實(shí)施例四

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于50wt%甲酸-1wt%鹽酸中浸泡30min。

（3）將酸浸泡蠶絲置于-20℃冷凍，然后置于25℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理20次后放入-20℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成絲蛋白多孔支架。

附圖4為上述制得的絲素蛋多孔支架的掃描電鏡圖片；由圖可見多孔支架主要為納米級和微米級纖維組成，直徑介于10nm~10μm，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

實(shí)施例五

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于98%甲酸中浸泡10min。

（3）將酸浸泡蠶絲置于-60℃冷凍，然后置于37℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理50次后放入-20℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成絲蛋白多孔支架。

附圖5為上述制得的絲素蛋多孔支架的掃描電鏡圖片；由圖可見多孔支架主要由蠶絲微米纖維組成，直徑介于10nm~10μm，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

實(shí)施例六

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于50wt%甲酸中浸泡30min。

（3）將酸浸泡蠶絲置于-20℃冷凍，然后置于4℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理10次后放入-20℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成絲蛋白多孔支架。

附圖6為上述制得的絲素蛋多孔支架的X-射線衍射圖；由圖可見多孔支架的結(jié)構(gòu)主要為SilkⅡ結(jié)晶結(jié)構(gòu)，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與物理力學(xué)性能。

實(shí)施例七

（1）天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得脫膠桑蠶絲。

（2）將脫膠蠶絲浸泡于80wt%甲酸中浸泡30min。

（3）將酸浸泡蠶絲置于-20℃冷凍，然后置于4℃復(fù)溫融化，重復(fù)凍-融處理15次后放入-20℃冷凍。

（4）將步驟（3）獲得的冷凍體置于凍干機(jī)中冷凍干燥成柞蠶絲蛋白多孔支架。