本申請要求2015年8月21日向韓國專利局提交的韓國專利申請No.10-2015-0118267的權益，其通過提述完整并入本文。

發明背景

1.領域

本公開涉及用于預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的組合物，用于促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的組合物，用于降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的組合物，預防或治療哺乳動物中神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的方法，促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的方法，和降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的方法。

2.相關領域說明

脫髓鞘疾病(demyelinating disease)是神經系統的疾病，其中神經元的髓鞘受損。該損傷損害受影響神經元中的信號轉導，繼而，根據受影響的是哪些神經，導致感覺、運動、認知或其他功能中的缺陷。脫髓鞘疾病可以包括影響中樞神經系統和周圍神經系統的疾病。周圍神經系統的脫髓鞘疾病包括格-巴二氏綜合征(Guillain-Barre Syndrome)和夏-馬-圖三氏(Charcot Marie Tooth,CMT)病。中樞神經系統的脫髓鞘疾病包括多發性硬化。已顯示抗壞血酸在動物模型中針對周圍神經病是有效的；然而，該化合物在臨床測試中失敗。因此，需要用于脫髓鞘疾病的基礎性治療的藥物。

發明概述

提供了用于預防或治療與哺乳動物中神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的組合物，該組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。

提供了用于促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的組合物，所述組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。

提供了用于降低哺乳動物的神經細胞中周圍髓磷脂蛋白22(PMP22)表達的組合物，所述組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。

提供了預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的方法，所述方法包括對該哺乳動物施用有效量的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，從而預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病。

提供了促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的方法，所述方法包括對該哺乳動物施用有效量的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，從而促進哺乳動物的神經細胞中的髓鞘再生或抑制脫髓鞘。

提供了降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的方法，該方法包括對哺乳動物施用有效量的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，由此降低該哺乳動物的神經細胞中PMP22的表達。

另外的方面部分將在以下說明書中列出，部分從說明書將是明顯的或可通過實踐所呈現的例示性實施方案而知悉的。

附圖簡述

從對例示性實施方案的以下說明連同所附附圖，這些和/或其它方面將變得明顯和更容易領會的。

圖1例示了通過大鼠施旺(Schwann)細胞的Western印跡的PMP22基因表達分析的結果，包括在存在以不同濃度(小圖A)和暴露時間(小圖B)的酚磺乙胺(ES)的情況下過表達的PMP22；

圖2提供使用共聚焦激光顯微鏡獲得的斑馬魚(Mbp:gal4；UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的顯微鏡圖像，和用于髓鞘形成、脫髓鞘和髓鞘再生的實驗規程的示意圖(小圖A-D)；

圖3例示了在不同條件下(小圖A-D)孵育的斑馬魚(Mbp:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的后側線神經(PLL)軸突周圍的髓磷脂上使用共聚焦激光顯微鏡的綠色熒光蛋白(GFP)--熒光顯微術的結果；

圖4例示了在不同條件下(小圖A-C)孵育的斑馬魚(Claudink:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的周圍神經系統的髓磷脂上使用共聚焦激光顯微鏡的GFP-熒光(綠色)顯微術和使用乙?；?微管蛋白染色(紅色熒光)的免疫熒光顯微術的結果；

圖5例示了從圖4中熒光圖像的熒光強度獲得的有髓鞘軸突對總軸突的比率；

圖6例示了在不同條件下(小圖A-C)孵育的斑馬魚(Claudink:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的中樞神經系統中Mauthner軸突和髓磷脂的切片上使用共聚焦激光顯微鏡的源自GFP的熒光顯微術和使用特異于軸突表達的乙?；?微管蛋白的免疫染色的紅色熒光顯微術的結果；

圖7是將g比率定義為軸突對神經纖維的直徑比的示意圖；和

圖8是從圖6的結果獲得的g比率的圖。

發明詳述

現將對例示性的實施方案進行詳細提述，其例子例示在附圖中，其中相似的參照編號從頭到尾指相似的要素。在此方面，目前的例示性實施方案可能具有不同形式且不應理解為受限于本文中陳述的說明。因此，下文僅通過參照附圖描述了例示性實施方案以解釋各方面。如本文中使用的，術語“和/或”包括一個/種或多個/種所列關聯項的任意和所有組合。表述如“至少一個/種”在置于一組要素之前時修飾整組要素而不修飾該組的單個要素。

根據本公開的第一方面，提供用于預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的組合物，所述組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。

根據本公開的第二方面，提供用于促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的組合物，所述組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。

根據本公開的第三方面，提供用于降低哺乳動物的神經細胞中周圍髓磷脂蛋白22(PMP22)表達的組合物，所述組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。

在根據本公開的第一、第二和第三方面的組合物中，所述2,5-二羥基苯磺酸可以可以為其藥學可接受的鹽的形式。藥學可接受的鹽的例子可以包括通常用于制藥領域的酸加成鹽，例如源自無機酸如鹽酸、溴酸、硫酸、氨基磺酸(sulfamic acid)、磷酸或硝酸的鹽；和源自有機酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、檸檬酸、馬來酸、丙二酸、甲磺酸、酒石酸、蘋果酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、2-乙酰氧基苯甲酸(2-acetoxybenzoic acid)、富馬酸、甲苯磺酸、草酸、或三氟乙酸的鹽。藥學可接受的鹽的例子可以包括堿加成鹽，例如源自堿如銨、二甲胺、一甲胺、一乙胺或二乙胺的鹽。藥學可接受的鹽的例子可以包括常見金屬鹽，例如源自金屬如鋰、鈉、鉀、鎂或鈣的鹽。上述酸加成鹽、堿加成鹽和金屬鹽可以根據本領域中常見的方法制備。例如，堿加成鹽或金屬鹽可以通過使2,5-二羥基苯磺酸的離子形式，即2,5-二羥基苯磺酸根/鹽與適宜堿(例如二乙胺)或金屬離子(例如鈣、鎂或鈉離子)反應而獲得。例如，所得堿加成鹽可以是2,5-二羥基苯磺酸二乙銨鹽(下文中的“酚磺乙胺(ethamsylate)”)。

2，5-二羥基苯磺酸的藥學可接受的鹽可以具有式1的結構。

在式1中，M可以是[NH_4-xR_x]⁺，其中x可以是0,1,2,3或4；且當x>1時，R(s)可以彼此相同或不同，例如，可以是分支或不分支的C_1-4-烷基(alkyl-radical)。

2,5-二羥基苯磺酸可以為其溶劑合物的形式。術語“溶劑合物”指包含或組成為至少一種溶質分子(即由式1代表的化合物或該化合物的藥學可接受鹽)；和至少一種溶劑分子的復合物或聚集物。溶劑合物可以是例如與水、甲醇、乙醇、異丙醇或乙酸形成的復合物或聚集物。

2,5-二羥基苯磺酸可以為化合物的立體異構體的形式。立體異構體的例子包括所有類型的立體異構體如對映異構體(enantiomer)和非對映異構體(diastereomer)。2,5-二羥基苯磺酸化合物可以為一種立體異構體的立體異構上純的形式或至少兩種立體異構體的混合物，例如外消旋混合物?？墒褂帽绢I域中已知的方法之一來實施特定立體異構體的分離。

2,5-二羥基苯磺酸可以是化學合成或商業購買的。

在本公開的第一、第二和第三方面中，所述組合物可以是藥物組合物。所述組合物可進一步包含藥學可接受的載體。如本文使用的，術語“藥學可接受的載體”指與活性成分組合使用的材料，其一般為惰性材料，以幫助活性成分的應用。藥學可接受的載體的例子通常可包括，藥學可接受的賦形劑、添加劑或稀釋劑。藥學可接受的載體的例子可包括選自下組的至少一種：填充劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、滑潤劑、調味劑、稠化劑、增色劑、乳化劑、懸浮劑、穩定劑和等滲劑。

所述組合物可以以“治療有效的量”包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。在組合物中，術語“治療有效的量”如用于本文指在對需要治療的受試者施用時產生治療效果的充足量。術語“治療/處理”如用于本文指治療受試者，如哺乳動物(包括人)的疾病或醫學狀況，例如與脫髓鞘有關的疾病，且治療的含義如下：(a)改善疾病或醫學狀況，如通過消除患者的疾病或醫學狀況或導致其消退；(b)抑制疾病或醫學狀況，如通過延緩或阻止患者的疾病或醫學狀況的進展；或(c)以任意程度減輕患者的疾病或醫學狀況的癥狀。所述組合物還可以用于疾病或醫學狀況的預防性(防護性)治療/處理。

所述組合物可包含“用于促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生的有效量的2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物”或“用于降低哺乳動物神經細胞中PMP22表達的有效量的2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物”?！坝行Я俊笨梢允怯杀绢I域普通技術人員適宜選擇的。例如，“有效量”可以在約0.01mg至約10,000mg、約0.1mg至約1000mg、約1mg至約100mg、約0.01mg至約1000mg、約0.01mg至約100mg、約0.01mg至約10mg、或約0.01mg至約1mg的范圍內。

所述組合物可包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物作為活性成分。術語“活性成分”指實現如上文描述的組合物的功能的成分，但排除其中活性成分量過少以致于表現如同雜質的情況。

所述組合物可以制備用于口服施用或胃腸外施用，包括靜脈內、腹膜內、皮下、直腸和局部施用。如此，組合物可以配制為多種形式，如片劑、膠囊劑、水性溶液、或懸浮劑。在用于口服施用的片劑的情況中，一般可向其添加賦形劑如乳糖或玉米淀粉和滑潤劑如硬脂酸鎂。在用于口服施用的膠囊劑的情況中，乳糖和/或干玉米淀粉可以用作稀釋劑。當需要用于口服施用的水性懸浮劑時，活性成分可以附著于乳化劑和/或懸浮劑。若需要，可將預確定的甜味劑和/或調味劑添加到組合物中。在神經內、肌內、腹膜內、皮下和靜脈內施用的情況中，通常制備活性成分的無菌溶液，其中需要適宜地調整無菌溶液的pH和將溶液緩沖。對于靜脈內施用，需要控制溶質的總濃度以使得配制的組合物等滲。組合物可配制成水性溶液的形式，其包含藥學可接受的載體，如pH 7.4的鹽水。水性溶液可以通過局部推注注射施用至患者的肌內或神經內血流中。

2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物可以抑制脫髓鞘或通過使神經元髓鞘再生來恢復脫髓鞘的神經元。

所述組合物可以與至少一種用于治療與脫髓鞘有關的疾病的其他治療劑組合使用?；蛘?，組合物可以包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，而沒有用于治療與脫髓鞘有關的疾病的任何其他活性成分。

所述組合物可以用于治療與哺乳動物神經細胞中的脫髓鞘有關的疾病。與神經元脫髓鞘有關的疾病(下文亦稱為“脫髓鞘疾病”)指神經系統疾病，其中神經元的髓鞘受損。神經元的髓鞘損傷可以包括降低神經元中信號轉導的任何損傷，包括結合神經元的髓磷脂的分離，或髓磷脂的量減少或結構變形。該損傷損害受影響神經中的信號轉導，繼而根據涉及的神經是哪些神經，其導致感覺、運動、認知或其他功能中的缺陷。該疾病可以包括影響中樞神經系統(亦稱為“中樞神經系統脫髓鞘疾病”)和周圍神經系統(亦稱為“周圍神經系統脫髓鞘疾病”)的疾病。中樞神經系統脫髓鞘疾病可以包括：多發性硬化、德維克病(Devic’s disease)、炎性脫髓鞘疾??；中樞神經系統神經病如由維生素B12缺乏所引起的那些；脊髓病如脊髓癆(Tabes dorsalis)，腦白質病(leukoencephalopathies)如進行性多灶性白質腦病(progressive multifocal leukoencephalopathy)，腦白質營養不良(leukodystrophies)；格-巴二氏綜合征；和慢性炎性脫髓鞘多神經病，其為格-巴二氏綜合征對應的慢性?。换蚱浣M合。周圍神經系統脫髓鞘疾病可以包括抗MAG周圍神經病、夏-馬-圖三氏(CMT)病、銅缺乏(copper deficiency)、進行性炎性神經病、或其組合。例如，與神經元脫髓鞘有關的疾病可以是多發性硬化、格-巴二氏綜合征、CMT病、或其組合。CMT病可以是CMT1A亞型、CMT1E亞型或CMT3亞型。

在所述組合物的一些實施方案中，與神經元脫髓鞘有關的疾病可以由PMP22的過表達導致。PMP22是在人中由PMP22基因編碼的蛋白質。該基因編碼的整合膜蛋白是主要在施旺細胞中表達的疏水性四分子交聯體(tetraspan)糖蛋白且是周圍神經系統中緊湊的髓磷脂的主要組分。盡管PMP22是周圍神經系統中緊湊的髓磷脂的主要組分，但根據如上文描述的實施方案的組合物可以不僅對于周圍神經系統的神經細胞，而且對于中樞神經系統的神經細胞也有效。已知PMP22與髓磷脂蛋白zero相互作用。該基因的多種突變是CMT1A、代-索二氏病(Dejerine-Sottas)、和易感于壓迫性麻痹的遺傳性神經病(HNPP)的起因。CMT1A是該病的最常見形式，所有CMT患者的至少60％屬于CMT1A。CMT1A由17號染色體上PMP22基因的重復導致。該CMT病不僅可以由具有基因的兩個拷貝導致，而且可以由具有基因的三個拷貝(包括在一條染色體上的兩個拷貝在另一條染色體上的一個拷貝)所導致。

在所述組合物的一些實施方案中，哺乳動物可以是人。哺乳動物可以具有脫髓鞘的神經元和/或與脫髓鞘有關的疾病。

在所述組合物的一些實施方案中，神經細胞中PMP22的過表達可以處于進展中或完成中。神經細胞可以處于由PMP22過表達導致的脫髓鞘的進展中或完成中。神經細胞可以在周圍神經系統和/或中樞神經系統中。神經細胞可以體內或體外存在或存活。在一個實施方案中，神經細胞是體外細胞系，例如購自美國典型培養物中心(ATCC)的施旺細胞。

根據本公開的另一個方面，提供預防或治療與哺乳動物神經細胞中PMP22過表達有關的疾病的組合物，該組合物包含2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物。如本文使用的，“PMP22的過表達”指相比于無髓鞘損傷的正常神經細胞(例如正常、健康受試者的神經細胞)增加的PMP22表達。PMP22的表達可以在mRNA水平或蛋白水平測量。mRNA水平可以通過使用RNA分離、核酸擴增方法如聚合酶鏈式反應(包括RT-PCR)等測量。蛋白水平可以通過使用層析如離子交換、大小排阻、親和層析等、過濾、鹽析等分離蛋白來測量。蛋白水平可以通過使用檢測方法來測量。例如，可以使用特異于PMP22的抗體的檢測方法如酶聯免疫吸附測定法?！癙MP22的過表達”指相比于正常神經細胞的，增加了例如5％或更多、10％或更多、50％或更多、100％或更多、5％至100％、10％至100％、20％至100％、5％至80％、5％至50％、10％至50％的PMP22表達。

根據本公開的另一個方面，提供了上文定義的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物在治療與脫髓鞘有關的疾病中的用途。

根據本公開的另一個方面，提供了上文定義的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物在制備用于治療與脫髓鞘有關的疾病的藥物中的用途；上文定義的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物在制備用于促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的藥物中的用途；和上文定義的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物在制備用于降低哺乳動物的神經細胞中PMP22的表達的藥物中的用途。根據本公開的另一個方面，提供了能夠降低PMP22表達的化合物用于治療與脫髓鞘有關的疾病或促進髓鞘再生的用途；和另外，能夠降低PMP22表達的化合物在制備用于治療與脫髓鞘有關的疾病或促進髓鞘再生的藥物中的用途。

根據本公開的第四方面，提供了預防或治療與哺乳動物的神經細胞中脫髓鞘有關的疾病的方法，該方法包括對該哺乳動物施用有效量的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，從而預防或治療與哺乳動物神經細胞的脫髓鞘有關的疾病。

根據本公開的第五方面，提供了促進哺乳動物神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的方法，該方法包括對該哺乳動物施用有效量的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，從而促進哺乳動物神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘。

根據本公開的第六方面，提供了降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的方法，該方法包括對該哺乳動物施用有效量的2,5-二羥基苯磺酸或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，由此降低該哺乳動物的神經細胞中PMP22的表達。

在本公開的第四、第五和第六方面中，除非另外定義，與關于本公開第一、第二和第三方面使用的那些相同的術語理解為具有與在第一、第二和第三方面中描述的相同的含義。

在本公開的第四方面中，脫髓鞘可以發生在中樞神經系統或周圍神經系統的神經細胞中。脫髓鞘可由PMP22過表達導致。與哺乳動物神經細胞中的脫髓鞘有關的疾病可以是CMT病、代-索二氏病、易感于壓迫性麻痹的遺傳性神經病(HNPP)、多發性硬化、或格-巴二氏綜合征。

在本公開的第五方面中，可以通過促進哺乳動物神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘來治療與脫髓鞘有關的疾病。所述神經細胞可以處于由PMP22過表達所致的脫髓鞘的進展中或完成中。脫髓鞘可以發生在中樞神經系統或周圍神經系統的神經細胞中。

在本公開的第六方面，可以通過降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達來治療與脫髓鞘有關的疾病。所述神經細胞可以處于由PMP22過表達所致的脫髓鞘的進展中或完成中。脫髓鞘可以發生在中樞神經系統或周圍神經系統的神經細胞中。

在根據本公開的第四、第五和第六方面的方法中，施用路徑可以由本領域普通技術人員適宜地選擇。例如，施用路徑可以是口服、胃腸外、或局部(local)或局部(topical)施用。局部施用可施用至神經系統，例如腦。

施用量可根據患者的狀況、施用路徑和醫師的決定而變化?？梢曰诮浻审w外或動物模型測試獲得的劑量-應答曲線獲得有效施用量。根據上文所述任一個實施方案的組合物中的化合物，即2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物的比率和/或濃度可根據化學屬性、施用路徑、和治療有效量來確定。對受試者施用量可以是，例如約1μg/kg至約1g/kg每日，或約0.1mg/kg至約500mg/kg每日的有效量。量可以根據受試者的年齡、重量、敏感性或癥狀而改變。

在本公開的第四、第五和第六方面中，所述方法可進一步包括在施用前收集關于受試者中神經細胞脫髓鞘的相關信息。關于脫髓鞘的相關信息可包括脫髓鞘水平、脫髓鞘速率、脫髓鞘類型等。關于脫髓鞘的相關信息可通過用光學或熒光顯微鏡或通過使用髓鞘特異性標志物觀察神經細胞獲得。因此，在本公開的第四、第五和第六方面中，所述方法可進一步包括測量神經細胞的脫髓鞘。所述神經細胞可以源自懷疑患有與脫髓鞘有關的疾病或潛在患有該病的受試者。所述方法還可以進一步包括基于收集的關于脫髓鞘的相關信息，確定脫髓鞘是否處于比對照組中更快的進展或完成態中。對照組可以具有與源自沒有脫髓鞘疾病的受試者的正常神經細胞或正常受試者的正常神經細胞的相似的髓鞘形成水平。所述方法可包括對受試者施用2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，所述受試者即在確定步驟中確定的處于比對照組中更多的脫髓鞘進展或完成的哺乳動物。

在本公開的第四、第五和第六方面中，所述方法可進一步包括在施用前測量受試者中或受試者的神經細胞中PMP22的表達水平。PMP22的表達水平可以在mRNA水平或蛋白水平測量。PMP22的表達可以通過擴增(例如聚合酶鏈式反應(PCR))、Southern印跡、或使用mRNA特異性引物核苷酸的序列分析，或通過分離PMP22表達蛋白、Western印跡等來測量。神經細胞可以源自患有與脫髓鞘有關的疾病或潛在具有該病風險的受試者。所述方法可進一步包括確定在測量步驟中獲得的PMP22的測量的表達水平是否高于對照組中的表達水平。對照組可以具有與源自沒有脫髓鞘疾病的受試者的正常神經細胞或正常健康受試者的正常神經細胞的相似的髓鞘形成水平。所述方法可以包括對受試者施用2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物，所述受試者即在確定步驟中確定為具有比對照組中的高的PMP22表達水平的哺乳動物。PMP22的高出的表達水平可以是至少約1％、約5％、約10％、約20％、約50％、約100％、約200％、約500％、約1000％、約1至約1000％、約5至約1000％、約10至約1000％、約20至約1000％、約50至約1000％、約100至約1000％、約200至約1000％、或約500至約1000％。

根據本公開的另一個方面，提供了促進哺乳動物神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的方法，該方法包括使哺乳動物的神經細胞與有效量的2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物接觸，從而促進哺乳動物神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘。所述神經細胞可以是從受試者分離的神經細胞或體外存活的神經細胞。

根據本公開的另一個方面，提供了降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的方法，該方法包括使哺乳動物的神經細胞與有效量的2,5-二羥基苯磺酸、或其藥學可接受的鹽或溶劑合物接觸，由此降低該哺乳動物的神經細胞中PMP22的表達。神經細胞可以是從受試者分離的神經細胞或體外存活的神經細胞。神經細胞可以是體外培養的神經細胞株系且所述方法在體外系統中進行。

在根據本公開的上述方面的方法中，所述接觸可以在液體培養基，例如神經細胞的培養基或緩沖液中實施。

現將參照以下實施例更詳細地描述本公開的一個或多個實施方案。然而，這些實施例僅用于例示性目的且不意圖限制本公開的一個或多個實施方案的范圍。

實施例

實施例1：酚磺乙胺對神經細胞中髓鞘再生的影響

(1)酚磺乙胺對神經細胞中PMP22表達的影響

將大鼠施旺細胞以約10⁵細胞/mL的濃度接種到12孔板的每個孔中，該孔中包含含有10％胎牛血清(FBS)、100單位/mL的青霉素、和100單位/mL的鏈霉素的2mL Dulbecco's Modified Eagle's培養基(DMEM)，并在5％-CO₂培養箱中在約37℃溫育至細胞密度為約60％至約65％。然后，將酚磺乙胺(二乙基銨2,5-二羥基苯磺酸(“ES”)，可從Selleckchem,TX獲得)以不同濃度添加到孔中，接著在相同條件下溫育約24小時。大鼠施旺細胞經常用在體外模型中用于神經元功能和分化。本文使用的大鼠施旺細胞是經過修飾以一致地過表達人PMP22基因的，其通過慢病毒介導將PMP22整合到染色體中，并選擇性使用嘌呤霉素抗性標志物，從而構建新的大鼠施旺PMP22細胞模型。該大鼠施旺細胞(ATCC編號；CRL-2768)購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。

在除去2mL培養基后，將所得大鼠施旺細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，接著向其添加含有溶于PBS中的0.5％triton X-100的裂解溶液，使用刮刀收集細胞，將細胞留置冰上約30分鐘，然后破壞細胞。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定法，將每份樣品中的蛋白量標準化至1ug/uL，繼之以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,Invitrogen)和使用兔抗PMP22(Novus biological)和兔抗肌動蛋白(Sigma)一抗以及綴合辣根過氧化物酶(HRP)的抗兔二抗的Western印跡。

圖1例示了通過Western印跡，對包含在存在酚磺乙胺情況下過表達的PMP22的大鼠施旺細胞的PMP22基因表達分析的結果。在圖1中，A和B均為Western印跡圖像，其中小圖A顯示在用溶于二甲亞砜(DMSO)中的0.1μM,1μM,10μM和100μM的酚磺乙胺處理約24小時的細胞中的PMP22蛋白表達。在圖1的小圖A中，“C”指對照組，包含作為溶劑的DMSO而不包含酚磺乙胺。實驗重復4次(n＝4)。圖1的小圖B顯示在用10μM的酚磺乙胺處理0,0.5,1,12,24和48小時的細胞中的PMP22蛋白表達，其中“0小時”指不添加酚磺乙胺的對照組。

如圖1的小圖A中顯示的，增加濃度的酚磺乙胺導致表達的PMP22蛋白的量降低。還發現在含有10μM酚磺乙胺的培養基中溫育0.5,1,12,24和48小時后PMP22蛋白的表達水平相比于對照組降低(圖1中的小圖B)。

(2)酚磺乙胺對體內PMP22表達的影響

通過用分別編碼Mbp:EGFP融合蛋白和Claudink:EGFP融合蛋白的基因轉化斑馬魚細胞來準備經轉化的斑馬魚(Danio rerio)，其中通過使用髓磷脂堿性蛋白(MBP)基因和Claudink基因的啟動子表達在髓磷脂中特異性表達并發射熒光的分別編碼Mbp:EGFP融合蛋白和Claudink:EGFP融合蛋白的基因。具體地，NfsB毒性基因編碼酶硝基還原酶(NTR)。NTR在典型的斑馬魚中不導致任何細胞毒性。然而，但向細胞添加甲硝噠唑(MTZ)時，細胞通過使用NTR將MTZ轉化成細胞毒性材料，其誘導細胞凋亡。通過使用mbp和claudink基因的啟動子(在分化的髓磷脂中特異性運行以表達結合髓磷脂的髓磷脂特異性基因和使用Gal4-UAS反式激活物系統，制備遺傳工程化的斑馬魚，即在分化的少突膠質細胞和施旺細胞中特異性表達NfsB毒性基因的經轉化的斑馬魚。接著，確認NfsB毒性基因在轉化的斑馬魚中髓磷脂特異性表達。

當將MTZ底物添加到在少突膠質細胞和施旺細胞中特異性表達NfsB毒性基因的該轉化的斑馬魚的培養基中時，發現在轉化的斑馬魚的少突膠質細胞和施旺細胞中誘導細胞凋亡，在該斑馬魚中mbp和claudink基因的啟動子特異性運行，且相應地誘導脫髓鞘。結果，建立了在存在MTZ的情況下誘導的脫髓鞘的動物模型。下文中，該動物模型也稱為斑馬魚(Mbp(或claudink):gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)。在從培養基除去添加的MTZ底物后，接著在沒有MTZ的培養基中培養轉化的斑馬魚1天，之后是恢復期。該研究(在下文更詳細描述)確認了脫髓鞘的中樞神經系統和周圍神經系統中發生天然髓鞘再生，以及ES藥物具有促進髓鞘再生的效果。

在含有1L水的約28.5°℃的水浴中，將100個斑馬魚溫育于卵水(egg water)或胚胎培養基(EM)(包含15mM NaCl，0.5mM KCl，1mM CaCl₂，1mM MgSO₄，0.15mM KH₂PO₄，0.05mM NH₂PO₄和0.7mM NaHCO₃)中達出生日起4.5dpf(受精后天數)，然后向其添加溶解于包含0.2％DMSO的EM的10mM MTZ(Sigma)以脫髓鞘36小時。斑馬魚被轉移到含有不同藥物的96孔板的孔中并在約28.5℃溫育(圖2小圖B)。一些斑馬魚通過在出生日起6dpf后用新EM將脫髓鞘的斑馬魚清洗3次以除去EM中的MTZ來允許髓鞘再生(圖2小圖C)。另一組斑馬魚在與小圖C相同的條件下溫育，只不過添加10μM ES(圖2小圖D，其中“化學處理”指ES處理)。在相同條件下溫育對照組，只不過添加0.2％DMSO而非MTZ。

圖2提供了使用共聚焦激光顯微鏡獲得的斑馬魚(Mbp:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的顯微鏡圖。在圖2的顯微鏡圖中，白色虛線框劃定了監測中樞神經系統和周圍神經系統的髓鞘再生的髓磷脂區域。中央最亮區域對應于中樞神經系統，而在中樞神經系統區域下面的相對暗的區域對應于周圍神經系統。在圖2中，在共聚焦激光顯微鏡圖像下面的小圖A-D提供了實驗過程的示意圖，即從出生日起3dpf的髓鞘形成(A)，在4.5dpf添加MTZ(B)，在6dpf洗掉或除去MTZ(下文中也稱為“恢復第1天”)(C)，和添加10μM的ES(D)。實施實驗直至7dpf，以一式18份進行(The test was performed by a multiple of 18)(n＝18)。在圖2中，指示“Zebrafish(Mbp(claudink):gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)”中的“Mbp(claudink)”意指"Mbp"或"claudink"啟動子可以等同地用于轉化的斑馬魚中。

圖3例示了在不同條件下孵育的斑馬魚(Mbp:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的后側線神經(PLL)軸突周圍的髓磷脂上使用共聚焦激光顯微鏡的綠色熒光蛋白(GFP)--熒光顯微術的結果。圖3，小圖A,B,C和D例示了如上文關于圖2中A,B,C和D和實驗過程描述的實施的實驗的結果。當如圖3小圖A中的在不存在MTZ和酚磺乙胺的情況下孵育斑馬魚時，在斑馬魚的周圍神經系統中存在充足的髓磷脂(圖3小圖A)。當在存在MTZ的情況下從約4.5dpf至7dpf(達約2.5天)培養斑馬魚時，幾乎沒有觀察到GFP熒光，表明大部分髓磷脂被除去(圖3小圖B)。當將在存在MTZ的情況下從4.5dpf至6dpf培養的斑馬魚進一步在通過洗滌從培養基除去MTZ后未添加ES的培養基中從6dpf溫育至7dpf(達約1天)時，周圍神經系統中的髓磷脂仍然部分未形成髓鞘(見圖3小圖C中的白色虛線區)。在另一方面，當在存在MTZ的情況下從4.5dpf至6dpf培養的斑馬魚進一步在通過洗滌從培養基除去MTZ后添加ES的培養基中從6dpf溫育至7dpf(達約1天)時，周圍神經系統中的髓磷脂完全髓鞘再生，從而在所有區域中均觀察到GFP來源的綠色熒光(圖3小圖D)。在圖3中，綠色熒光的強度與髓鞘形成的程度成比例。

圖4例示了在不同條件下孵育的斑馬魚(Claudink:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的周圍神經系統的髓磷脂上使用共聚焦激光顯微鏡的GFP-熒光(綠色)顯微術和使用乙?；?微管蛋白染色(紅色熒光)的免疫熒光顯微術的結果。比Mbp啟動子更特異性地作用于髓磷脂的Claudink啟動子可以用于更定量地觀察神經細胞中的脫髓鞘和髓鞘再生。在圖4中，“claudink”和“ac-微管蛋白”分別指示通過claudink啟動子由在髓磷脂中特異性表達的GFP產生的綠色熒光圖像和利用在軸突中特異性表達的乙?；⒐艿鞍椎拿庖呷旧a生的紅色熒光圖像，且"merge"指示兩個圖像的融合圖像。乙?；⒐艿鞍椎拿庖呷旧褂每剐∈笠阴；⒐艿鞍滓豢购途Y合Alexa647的抗小鼠二抗實施以測量藍色熒光，接著是藍色到紅色轉化以用于相對于綠色熒光的高對比度成像。下文中，乙?；⒐艿鞍椎拿庖呷旧耘c此處描述的相同方式實施。在圖4中，"PLL髓磷脂"指示PLL的軸突周圍的髓磷脂。如圖4中顯示的，發現ES促進髓鞘再生。圖4小圖A,B和C分別指示在相同條件下與圖2的A,B和D相同的實驗過程。

圖5例示了從圖4中熒光圖像的熒光強度獲得的有髓鞘軸突對總軸突的比率。在圖5中，"Cont","MTZ"和"酚磺乙胺"分別指示來自圖4的小圖A,B和C的結果。有髓鞘軸突對總軸突的比率表示為圖4中顯示的通過claudink啟動子由在髓磷脂中特異性表達的GFP產生的綠色熒光強度相對于通過在軸突中特異性表達的乙?；⒐艿鞍椎拿庖呷旧a生的紅色熒光強度的比率。

如圖4和5中顯示的，有髓鞘軸突對總軸突的比率在存在ES的情況下顯著高于用MTZ處理的樣品，表明ES促進脫髓鞘的神經細胞中的髓鞘形成。

圖6例示了在不同條件下孵育的斑馬魚(Claudink:gal4::UAS:nfsB(NTR,毒素)::UAS:gfp)的中樞神經系統中Mauthner軸突和髓磷脂的切片上使用共聚焦激光顯微鏡的源自GFP的熒光顯微術和使用特異于軸突表達的乙?；?微管蛋白的免疫染色的紅色熒光顯微術的結果。圖6，小圖A,B和C分別指示來自在相同條件下，與圖2和3中的小圖A,B和D相同的實驗過程的結果。在圖6中，小圖A指在既不包含MTZ也不包含ES的培養基中培養的對照組。通過用Image J程序從源自GFP的熒光和紅色軸突熒光的強度計算直徑而獲得軸突和纖維直徑。

圖7是將g比率定義為軸突對神經纖維的直徑比的示意圖。

圖8是從圖6的結果獲得的g比率的圖。在圖8中，“Cont”,“MTZ”和“酚磺乙胺"分別指示來自圖6的A,B和C的結果。如圖8中顯示的，酚磺乙胺處理組相比于MTZ處理組具有顯著降低的g比率，表明軸突的髓磷脂層在酚磺乙胺處理組中變得顯著更厚。如圖6和8中顯示的，在存在MTZ的情況下溫育的斑馬魚的中樞神經系統中損壞或脫髓鞘的神經細胞在酚磺乙胺的存在下溫育時比其他情況以顯著更高的效率再生或髓鞘再生。

如上文實施方案中描述的，根據所述一個或多個實施方案，用于預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的組合物可以預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病。用于促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的組合物，如上文實施方案中描述的，可以促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘。用于降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的組合物，如上文實施方案中描述的，可以降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達。預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病的方法，如上文實施方案中描述的，可以有效預防或治療哺乳動物中與神經細胞的脫髓鞘有關的疾病。促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘的方法，如上文實施方案中描述的，可以有效促進哺乳動物中神經細胞的髓鞘再生或抑制脫髓鞘。降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達的方法，如上文實施方案中描述的，可以降低哺乳動物的神經細胞中PMP22表達。

應理解本文中描述的例示性實施方案應僅以描述性含義考慮，而不是用于限制目的。在每個例示實施方案中的特征或方面的描述通常應視為可用于其他例示實施方案中的其他類似特征或方面。

雖然已參照附圖描述了一個或多個例示性實施方案，但本領域普通技術人員應理解可在其中進行形式和細節的多種變化而不背離由權利要求限定的精神和范圍。