本發明屬于生物技術，具體涉及一種基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，并進一步公開其制備方法與應用。

背景技術：

1、外泌體(exosomes，exo)是細胞分泌到細胞外的球狀膜性囊泡，是一種內源膜性納米級囊泡。外泌體可以實現細胞間的物質運輸和信息傳遞，諸如蛋白質、脂質、核酸等小分子物質可以通過外泌體從供體細胞轉移到受體細胞。因此，外泌體是一種天然良好的納米級給藥載體，且由于外泌體具有生物穩定性、靶向特異性、低毒性和低免疫原性等優勢，使得外泌體在藥物遞送中具有非常大的潛力。

2、目前，外泌體裝載藥物的方式主要分為兩種方式，即內源性裝載和外源性裝載。內源性裝載是通過直接對來源細胞進行改造，將目的分子導入來源細胞，然后再分離純化出外泌體。外源性裝載則是在分離純化出的外泌體利用膜穿透或者膜融合等技術將藥物直接裝載在外泌體中。

3、外源性裝載的方式主要包括直接共孵育、電穿孔、超聲處理、擠壓、反復凍融和表面活性劑透化等技術。然而，直接共孵育和反復凍融裝載方式存在效率低以及不能裝載大分子藥物的缺陷；電穿孔和超聲處理裝載方式則極易改變外泌體形態，容易造成外泌體聚集且需要特殊的儀器；而表面活性劑透化裝載方式則會導致某些表面活性劑很難完全去除，尤其是殘留的表面活性劑可能引起細胞的毒性，破壞外泌體的結構。

4、因此，本領域期待開發一種裝載效率高且對外泌體結構影響和細胞毒性較小的外泌體藥物遞送系統，對于新型藥物的開發具有積極的意義。

技術實現思路

1、為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，所述外泌體藥物遞送系統不僅裝載效率高且對外泌體結構影響和細胞毒性較??；

2、本發明所要解決的第二個技術問題在于提供上述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述方法無需特殊的儀器和設備，具有可操作簡單的優勢。

3、為解決上述技術問題，本發明所述的一種基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)分別配制含有核酸、外泌體和ca2+的反應a液以及含有po42-磷酸根離子的反應b液，并將所述反應a液與反應b液混合，得到混合液；

5、(2)將所述混合液進行第一孵育處理；

6、(3)繼續加入核糖核酸酶(rnase)混合并進行第二孵育處理，即得。

7、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述步驟(1)中，所述核酸包括小分子核酸藥物，優選包括mirna、sirna和/或aso。

8、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法：

9、所述核酸藥物基于所述混合液的添加量為1-100pmol/100μl，優選添加量10-200pmol/300μl，更優選70pmol/300μl；和/或，

10、所述外泌體基于所述混合液的添加量為109-1011particles/ml，優選1010particles/ml；和/或，

11、所述ca2+基于所述混合液的添加濃度為0.01-1m，優選濃度0.05-0.5m，更優選為0.1mol/l；和/或，

12、所述po42-基于所述混合液的添加濃度為2-8mm，優選濃度2-5mm，更優選濃度為2.5mm。

13、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述ca2+與po42-的濃度比為20-100：1。

14、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述反應b液包括pbs緩沖液或hbs緩沖液；

15、優選所述pbs緩沖液或hbs緩沖液的ph為7.0-7.5。

16、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述反應a液、所述反應b液彼此獨立的還包括dnase、rnase-free水。

17、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述步驟(2)中，所述第一孵育處理包括：將所述混合液依次于0-4℃孵育20-40min、40-45℃孵育40-80s、以及于0-4℃孵育3-8min的步驟。

18、具體的，所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，所述步驟(3)中，所述第二孵育處理的溫度為35-40℃，孵育時間20-40min；

19、優選的，所述步驟(3)中，所述核糖核酸酶(rnase)基于所述混合液的加入量為3-8μg/ml，優選5μg/ml。所述rnase可以消化游離mirna，防止在檢測mirna的表達時和后續的實驗造成較大的誤差。

20、本發明還公開了一種由所述方法制備得到的基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統。

21、本發明還公開了所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統用于制備核酸藥物的用途；

22、可選的，所述核酸藥物包括治療腫瘤的核酸藥物。

23、本發明所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，通過ca2+和磷酸鹽構建形成磷酸鈣介導的外泌體遞送體系，通過氯化鈣轉染mirna后可以將核酸藥物載入到外泌體中，外泌體中mirna的含量顯著提高，進而借助于外泌體的遞送性能將藥物運輸，有效提高了藥物的載藥效率和遞送效率，具有裝載效率高的優勢。

24、本發明所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，通過調整ca2+與po42-的濃度，控制二者比例越高裝載效率更優，可有效提高外泌體的載藥量和載藥效率。

25、本發明所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，使用的碳酸鈣以及磷酸鈣作為生物體中的成分之一，其具有良好的生物相容性，不僅對外泌體結構影響和細胞毒性較小，同時也具有較好的ph響應性，在腫瘤微環境中能夠更好的釋放，發揮更好的治療效果。

26、本發明所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，不需要特殊的儀器和設備，且具有制備方法操作簡單的優勢。

技術特征：

1.一種基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據權利要求1所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述核酸包括小分子核酸藥物，優選包括mirna、sirna和/或aso。

3.根據權利要求1或2所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于：

4.根據權利要求1-3任一項所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，所述ca2+與po42-的濃度比為20-100：1。

5.根據權利要求1-4任一項所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，所述反應b液包括pbs緩沖液或hbs緩沖液；

6.根據權利要求1-5任一項所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，所述反應a液、所述反應b液彼此獨立的還包括dnase、rnase-free水。

7.根據權利要求1-6任一項所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述第一孵育處理包括：將所述混合液依次于0-4℃孵育20-40min、40-45℃孵育40-80s、以及于0-4℃孵育3-8min的步驟。

8.根據權利要求1-7任一項所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述第二孵育處理的溫度為35-40℃，孵育時間20-40min；

9.一種由權利要求1-8任一項所述方法制備得到的基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統。

10.權利要求9所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統用于制備核酸藥物的用途。

技術總結
本發明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，并進一步公開其制備方法與應用。本發明所述基于磷酸鈣介導的外泌體藥物遞送系統，通過Ca<supgt;2+</supgt;和磷酸鹽構建形成磷酸鈣介導的外泌體遞送體系，通過氯化鈣轉染miRNA后可以將核酸藥物載入到外泌體中，外泌體中miRNA的含量顯著提高，進而借助于外泌體的遞送性能將藥物運輸，有效提高了藥物的載藥效率和遞送效率，具有裝載效率高的優勢。

技術研發人員：宋媛,梁棟科,付瑞鋒,王光幸,嚴冰浩
受保護的技術使用者：上海瑛泰生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28