[0142] 結果：實時定量PCR結果顯示，在CK2a敲降的Raw264. 7細胞中，LPS和polyI:C 誘導的IFNf3和CxcllO的表達明顯比對照細胞中高（圖1)。相應的，在LPS和polyI:C處 理的CK2α敲降的Raw264. 7細胞中，IFNI3誘導的靶基因Mxl和Mx2的表達量也大大增高 了（圖1)。相反，炎癥因子TNFa和趨化因子CXCL1的表達與對照組相比沒有顯著性的差 別（圖1)，表明CK2選擇性地抑制I型干擾素及其I型干擾素誘導的基因表達。通過特異 性識別蛋白磷酸化的抗體，利用Western雜交檢測LPS誘導的TLR4信號通路中信號分子的 活化，發現在CK2α敲降的Raw264. 7細胞中，參與I型干擾素誘導的關鍵性信號分子TBK1 和IRF3的磷酸化明顯增高，但是MAPKinasesJNK、ERK、p38的磷酸化則沒有明顯的變化 (圖2)。相反，IκΒα的磷酸化反而下降了（圖2)。這些數據顯示CK2 -方面抑制TBK1 和IRF3的活化，另一方面正調節IKKα/β和NFκΒ的活化，因此CK2在TLR信號通路中針 對不同的信號分子，具有不同的調節作用。
[0143] 同樣，在CK2敲降的L929細胞中，轉化入胞漿的polyI:C、polydA:dT和DMXAA通 過激活RIG-I/MDA5或者cGAS/STING信號通路，誘導更多的IFNa、IFN0、CxcllO、Mxl和 Mx2 (圖3A)。表明CK2也參與調節胞漿內的RNA和DNA等模式識別受體所誘導的I型干擾 素及其I型干擾素誘導的基因表達。同樣通過Western雜交，發現轉化的polyl:C在CK2 敲降的L929細胞內激活更多的TBK1和IRF3,相應地，I型干擾素激活的p-STATl在CK2敲 降的L929細胞也明顯比對照細胞中要高（圖3B)。在DMXAA刺激的CK2敲降的L929細胞 核中，不僅P-TBK1上升，而且IRF3的核轉移也明顯上調（圖3C)。相反，NFκΒp65的核轉 移并沒有顯著增加（圖3C)。進一步證明CK2特異性的抑制TBK1和IRF3的活化，以此調節 多種模式識別受體介導的I型干擾素及其I型干擾素誘導基因的表達。
[0144] 實施例2蛋白激酶CK2參與調控多種病毒感染誘導的I型干擾素表達
[0145] 方法：將對照和CK2α敲降的穩轉細胞系以106個/ml分別接種到6孔板中，每孔 接種 2ml。分別感染DNA病毒HSV-1 (1X107pfu/ml)、RNA病毒水泡病毒VSV(2. 5X105TCID5。/ ml)和仙臺病毒SeV(lX10sHA/ml)。感染病毒6小時后，收集細胞用于RNA抽提制備。感染 HSV病毒6小時后，換液、繼續培養66小時收集細胞上清液用于HSV病毒滴度測定。利用 TRIZOL(Invitrogen)方法提取Raw264. 7 和L929 的RNA,并用Superscript?IIIReverse TranscriptaseKit(Invitrogen)分別反轉錄1μgRNA合成第一鏈cDNA，用于實時定量 PCR檢測基因表達水平。實時定量PCR引物詳見附件表格1。運用△Act方法計算所測基 因相對于GAPDH的相對表達量。用經典病毒滴度測定法檢測細胞上清液中HSV的病毒滴 度，具體方案為：以5X104個/ml分別接種Vero細胞到24孔板中，每孔接種0. 5ml，待細胞 豐度達到30 %時，分別加入不同濃度梯度的細胞上清液（原液、1:101、1:102、1:103、1:10 4、 1:105、1:106、1:107、1:10s、1:109、1:101°)和空白對照培養4小時。4小時后，去除上清液，每 孔加入0. 8%的瓊脂-MEM培養液400μ1，常溫靜置1小時待培養基凝固后，繼續倒置培養 67小時。培養結束后，每孔加入500μ1結晶紫溶液，常溫靜置2小時。抽掉瓊脂，計數空斑 的數目，計算病毒滴度（pfu/ml,plaqueformingunit/ml)〇
[0146] 結果：實時定量PCR結果顯示，在CK2a敲降的Raw264.7細胞中，HSV誘導的 IFNa、IFNI3和CxcllO的表達明顯比對照細胞中高（圖4)。相應的，IFNa/β的靶基因 Mxl和Μχ2的表達也在CK2α敲降的Raw264. 7細胞中大大增高了（圖4)。隨著I型干擾 素及其靶基因產物的大量表達，HSV病毒的復制、組裝和釋放受到顯著的抑制，在CK2a敲 降的Raw264. 7細胞培養液中檢測到的HSV病毒滴度比對照組的要低接近10倍（圖4)。同 樣，與對照細胞相比，在CK2敲降的L929細胞中，VSV和SeV誘導的IFNa、IFN0、Cxcll0、 Mxl和Mx2等基因的表達也極其顯著地上調（圖5和圖6)。因此在多種病毒感染狀態下， 下調CK2的表達均能顯著增強不同類別細胞表達I型干擾素的能力。這些結果表明CK2是 負調控I型干擾素表達的關鍵性分子。
[0147] 實施例3CK2的激酶活性在調控I型干擾素表達中起著關鍵性的作用
[0148] 方法：在lenti-viral載體p⑶Η上分別克隆編碼小鼠CK2α野生型和激酶失活的 突變體（K68M)的cDNA，然后將它們轉導入L929細胞系，通過puromycin篩選得到對照細胞 株，分別表達野生型和突變型CK2a的細胞株。通過Western雜交驗證了野生型和突變型 CK2a的表達（圖7A)。
[0149] 將表達野生型和突變型CK2a的細胞株以106個/ml分別接種到6孔板中，每孔接 種 2ml。VSV(2. 5X105TCID5Q/ml)感染 6 小時后，利用TRIZOL(Invitrogen)法抽提制備細 胞中的RNA。用Superscript?IIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分別反轉錄 1μgRNA合成第一鏈cDNA，用于實時定量PCR檢測I型干擾素基因表達水平，運用ΔΔct 方法計算所測基因相對于GAPDH的相對表達量。
[0150] 結果：實驗表明，在高表達野生型CK2a的細胞中，IFNa、IFNf3和CxcllO等基因 的表達量比對照細胞低（圖7B)。相反，在高表達無激酶活性的CK2 a突變體細胞中，這些 基因的表達量與對照細胞比沒有明顯差別（圖7B)。這些結果表明上調CK2的表達能降低 細胞誘導I型干擾素的能力，而且CK2的激酶活性在調節I型干擾素表達中是必不可少的。
[0151] 實施例4抑制CK2激酶活性促進細胞表達I型干擾素，阻止水泡病毒感染
[0152] 4. 1方法：將小鼠成纖維細胞L929以106個/ml分別接種到6孔板中，每孔接 種2ml，待細胞豐度達到70 %時，使用不同濃度CK2激酶抑制劑一小分子化合物TBB或 DMS0 (對照）處理該細胞6小時或12小時后，利用裂解緩沖液（50mMTris-HCl(pH7. 4)、 150mMNaCl、lmMEDTA，1%TritonX-100,蛋白酶抑制劑Complete(Roche)、lmMPMSF、lmM NaF、lmMNa3V04)提取并制備細胞的蛋白裂解液，通過Western雜交檢測NFkBp65和TBK1 的磷酸化。
[0153] 結果：圖8A的結果表明20μΜTBB處理L929細胞6小時后，CK2的激酶活性被抑 制，它所介導的Ρ65磷酸化明顯降低。但總體而言，100μΜΤΒΒ處理12小時能更有效地抑 制CK2的活性，而且能最有效地激活誘導I型干擾素表達的關鍵性激酶ΤΒΚ1 (圖8Α)。
[0154] 4. 2方法：同法使用ΤΒΒ(100μΜ)或DMS0 (對照）處理L929細胞12小時后， 利用TRIZOL(Invitrogen)法抽提制備細胞中的RNA。用Superscript?IIIReverse TranscriptaseKit(Invitrogen)分別反轉錄1μgRNA合成第一鏈cDNA，用于實時定量 PCR檢測I型干擾素基因表達水平，運用ΔΔct方法計算所測基因相對于GAPDH的相對表 達量。
[0155] 結果：發現TBB處理促進細胞合成IFNa、IFN0、CxcllO、Mxl和Mx2等基因的表 達（圖8B)，因此可能建立了一個抗病毒感染的狀態。果然，用0、20、50、100以1的了88分別 處理L929細胞12小時后，再接種VSV病毒（2. 5X105TCID5Q/ml，表達GFP，因此可以利用熒 光顯微鏡檢測被感染的細胞）；24小時后，利用熒光顯微鏡檢測VSV感染的效率。發現TBB 預處理的細胞呈現出對VSV感染的抗性，而且隨著TBB濃度的增加，抗VSV感染的能力也變 強。需要特別指出的是，1〇〇μΜTBB處理后的L929細胞幾乎完全不被VSV感染，具備了抵 御病毒感染的能力（圖9)。
[0156] 4. 3在人胚胎腎細胞ΗΕΚ293Τ中，驗證了抑制CK2的激酶活性對細胞表達I型干擾 素的影響以及在阻止水泡病毒感染中的作用。
[0157] 方法：將人胚胎腎細胞ΗΕΚ293Τ以106個/ml分別接種到6孔板中，每孔接種2ml， 待細胞豐度達到70%時，使用TBB或DMS0 (對照）處理細胞。同法提取細胞的蛋白裂解液 用于Western檢測，提取RNA用于I型干擾素相關基因表達水平的檢測，熒光顯微鏡檢測 VSV感染的效率。
[0158] 結果：實驗發現，在人胚胎腎細胞HEK293T中，TBB處理12或24小時后，TBK1也 被明顯地激活（圖10A)，并促進了IFNa、IFNf3、Mxl和Mx2等基因的表達（圖10B)。更重 要的是，TBB處理后的HEK293細胞抵抗VSV感染的能力也極大地增強（圖10C)。這些結 果說明TBB在小鼠和人細胞中均能誘導I型干擾素的表達，建立抗病毒感染的防御狀態，有 效地抵抗VSV病毒的感染。
[0159] 實施例5CK2抑制劑TBB阻止HCV感染
[0160] HCV感染導致的慢性肝炎在中國和世界范圍內都呈增加的趨勢。在人肝癌細胞 Hu7. 5中，HCV病毒可以非常有效地感染和復制，但不能誘導I型干擾素的表達。因此，外源 給予干擾素治療對一部分HCV慢性感染病人有較好的效果，但干擾素價格昂貴，且副作用 明顯。所以，探究能否利用TBB來誘導宿主自體產生I型干擾素，以達到治療HCV感染的效 果。
[0161] 方法：將Hu7. 5細胞以5X104個/ml分別接種到6孔板中，每孔接種2ml，使用的 培養基是〇1^1完全培養基。待細胞豐度達到30%時，10(^1188或0130(對照）處理24 小時后，MOI(multiplicityofinfection) =0· 01 或者Μ0Ι=0· 1 的HCV感染 8 小時后， 換液、繼續培養64小時。收集細胞分別用于RNA分析和HCV感染的效率，收集細胞上清液用 于HCV病毒滴度測定。用經典病毒滴度測定法檢測細胞上清液中HCV的病毒滴度，具體方 案為：以5X104個/ml分別接種Hu7. 5細胞到96孔板中，每孔接種200μ1，待細胞豐度達 到30 %時，分別加入不同濃度梯度的細胞上清液（原液、1:101、1:102、1:103、1:10 4、1:105、 1:106、1:107、1:10s、1:109、1:101°)，繼續培養72小時，收集細胞，多聚甲醛固定后免疫熒光 化學法標記HCV特異性抗體，熒光顯微鏡檢測已被HCV感染并帶有熒光標記的Hu7. 5細胞 個數，計算病毒滴度（ffu/ml,fluorescenceformingfoci/ml)〇
[0162] 結果：同法提取分析細胞中的RNA與I型干擾素相關基因的表達水平，定量PCR結 果表明，在TBB預處理的細胞中，IFNa、IFNf3、Mxl和Mx2等I型干擾素相關基因的表達較 高；同時，TBB預處理也提升了細胞中炎癥因子IL-6的表達（圖11A)。相反，Hcv基因的表 達量則非常少（圖11A)。細胞經4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS磷酸緩沖液洗滌，應用免 疫熒光化學法標記HCV特異性抗體，熒光顯微鏡檢測HCV感染效率。發現未受處理的細胞 大量感染HCV，但TBB處理后僅僅有極少的細胞被HCV感染（圖11B)。HCV的病毒滴度檢測 結果顯示，TBB預處理后，細胞上清液中HCV病毒的滴度明顯降低（圖11C)。以上研究結果 綜合表明TBB預處理能促進肝臟細胞Hu7. 5產生I型干擾素，阻止HCV的感染和復制。
[0163] 實施例6TBB抑制HCV復制、清除HCV感染
[0164] 方法：將Hu7. 5細胞以5X104個/ml分別接種到6孔板中，每孔接種2ml，待細胞 豐度達到 30%時，首先用MOI(multiplicityofinfection) =0.01 或者Μ0Ι= 0.1 的HCV 感染細胞，24小時后，HCV已經進入細胞并開始復制，再使用100μΜTBB或DMS0 (對照）處 理感染后的Hu7.