專利名稱：聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯及其制備方法
技術領域：
本發明涉及無機化學及生物醫學領域，具體涉及ー種可用作細胞轉染試劑的聚乙 ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯及其制備方法。
背景技術：
轉染是指將外源DNA導入細胞，從而獲得新的遺傳性狀的過程。基因轉染技術是研究基因功能和基因治療的重要技術之一。轉染試劑是基因轉染技術的核心，理想的基因轉染試劑應具備如下特點高轉染效率，低細胞毒性，生物安全性好，操作簡便等。目前的轉染試劑可以分為兩類病毒載體和非病毒載體。病毒載體的轉染效率高，但存在潛在的生物安全性問題。非病毒載體包括脂質體，高分子聚合物以及納米顆粒。具有轉染效率低，細胞毒性高等問題。因此我們需要建立一個有效快捷而安全的轉染試劑將目的基因運送到細胞中。目前，昆蟲細胞廣泛應用于醫學、農業及生物學的各個方面。有研究表明，基因的表達調控與蛋白質的翻譯后加工(例如糖基化以及乙酰化過程)在昆蟲細胞中和哺乳細胞中相似，因此利用昆蟲細胞如果蠅細胞將外源基因導入，從而研究基因的瞬時表達及功能得到了廣泛的關注。與貼壁的哺乳動物細胞相比，昆蟲細胞是一種半貼壁細胞，利用傳統的轉染技木，如磷酸鈣共沉淀法，其轉染效率較低。現在，有不同的商業化的轉染試劑，如Lipofectamine 2000是ー種應用較為廣泛的轉染試劑，對于貼壁的哺乳動物的轉染效率較高，但對于昆蟲細胞的轉染效率低。 Effectene是QIAGEN公司研發的針對原代細胞以及敏感性細胞系的轉染試劑，其轉染效率優于Lipofectamine 2000，但其對昆蟲細胞的轉染效率仍較低。聚乙烯亞胺是ー種高分子聚合物，帶正電荷的陽離子聚合物能與帶負電荷的DNA相互作用，從而能將DNA導入細胞， 其轉染效率較高，但細胞毒性高。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的不足，本發明提供了一種聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，作為ー種高效且安全的基因轉染試劑進行應用。為達到上述發明目的，本發明的技術方案是
一種聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺，所述聚乙ニ醇為支鏈結構，6條支鏈的一端分別連接在葡萄糖分子的羥基上，另一端都為氨基，數均分子量為10000 ；所述聚乙烯亞胺為支鏈結構，分子質量為25000 ；以所述氧化石墨烯、聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺為原料，制備得聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，所述聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的高度為Inm 2nm，尺寸為5nm 50nmo上述聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的制備方法，其中聚乙ニ醇修飾氧化石墨烯的方法可參照劉莊課題組的，通過Hummers方法制備氧化石墨烯，超聲處理5分鐘后，向其中加入聚乙ニ醇并繼續超聲處理5分鐘。上述兩種材料的區別在于1，本專利中采用的氧化石墨烯和聚乙ニ醇的投料比為1:1，而劉莊課題組發表的文章中的材料的采用的投料比為1:5，；2，本專利中所使用的材料中引入了高分子聚乙烯亞胺。(參見YANG K, et al. Nano Lett. , 2010，10 (9)，3318 - 3323)
由于上述技術方案的運用，本發明與現有轉染試劑相比具有下列優點 本發明的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯制備簡單，并且其對昆蟲細胞的轉染效率較高，在氮磷比30時即可達到70%左右；同時，聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯對細胞活性影響較低，在氮磷比30的濃度條件下，細胞能保持93%左右的活性。對于貼壁的哺乳動物細胞，聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的轉染效率與 Lipofectamine 2000相近。因此，本發明的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，可用作基因轉染試劑，有效且安全將基因輸送到細胞中。通過實驗，以綠色熒光蛋白基因作為報告基因，利用制備的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯轉染DNA進入果蠅細胞，發現其具有以下優點
1.超螺旋質粒DNA轉染效率較高。在氮磷比為30吋，其轉染效率能高達70%左右，明顯高于商業化轉染試劑以及PEI。2.線性DNA轉染效率高。質粒DNA放置一段時間后，其會斷裂行成線性DNA，研究了聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯對線性DNA的轉染效率后，發現其效率比PEI 和Lipofectamine 2000能高出10倍以上。3.操作簡便。一般的轉染試劑，如Lipofectamine 2000需在無血清的條件下進行轉染，而本發明的轉染試劑聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯則可以在有血清的條件下進行。4.細胞活性高，生物安全性好。通過MTT實驗，發現聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯在氮磷比30的濃度條件下處理細胞M小時后，細胞的活性能保持93%左右，生物安全性高。


圖1為實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的原子力顯微鏡圖。圖2為實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的紅外圖。圖3為實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的熱重分析圖。圖4為實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯與其他轉染試劑的轉染效率對比表。圖5為實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯對果蠅細胞的細胞活性分析圖。
具體實施例方式實施例1 制備昆蟲細胞轉染試劑聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k-PEI)
以1克膨脹石墨為起始原料，與約30克氯化鈉固體混勻研磨至無明顯肉眼可見顆粒， 然后加蒸餾水溶解抽濾，洗滌除去氯化鈉，將得到的固體烘干備用。將烘干的已研細的石墨加入三角燒瓶中，井向其中加入約30毫升的濃硫酸，室溫攪拌8小吋。然后將三角燒瓶置于冰浴中，緩慢加入約3克高錳酸鉀固體，并加熱至115°C，接著向三角燒瓶內加入約150毫升蒸餾水，之后加入約10毫升30%過氧化氫溶液并攪拌，離心除去上層水溶液，最后反復水洗離心至不再有沉淀出現為止。然后取5毫升3毫克/毫升的氧化石墨烯懸濁液超聲處理 30分鐘，接著向溶液中加入約1. 8克氫氧化鈉固體，50°C水浴攪拌4小時，然后用濃鹽酸調整溶液PH值為1左右。最后用蒸餾水離心洗滌至溶液呈中性，得到水溶性良好的堿化石墨烯溶液。取1毫克堿化石墨烯溶液并稀釋至5毫升，將稀釋的堿化石墨烯溶液超聲處理5 分鐘后向其中加入1毫克聚乙ニ醇，然后繼續超聲5分鐘，接著向溶液中加入約1毫克EDC 并繼續超聲20分鐘，再接著向溶液中加入約5毫克聚乙烯亞胺并超聲5分鐘，再次向溶液中加入約2. 5毫克EDC，繼續超聲20分鐘后室溫攪拌過夜。用100納米的濾膜抽濾純化即可得到聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k-PEI)。對上述聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k_PEI)進行原子力顯微鏡(AFM)分析，得圖1，從圖可知聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯尺寸是 5nm_50nm,高度為 lnm-2nm。對上述聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k_PEI)進行紅外分析(IR)，得圖2，熱重分析(TGA)，得圖3，從圖可知聚乙ニ醇(PEG)和聚乙烯亞胺 (PEI)都有效地連接到氧化石墨烯(GO)上。對上述聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k_PEI)進行元素分析，可得聚乙ニ醇(PEG)的質量百分比為洲左右，聚乙烯亞胺(PEI)的質量百分比為 37 士 3%。實施例2:研究實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯 (G0-6NH2-PEG-25k-PEI)作為昆蟲細胞轉染試劑的應用
將實施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯 (G0-6NH2-PEG-25k-PEI)和質粒pTub_GFP或線性pTub_GFP在室溫下相互結合，然后進行轉染，通過觀察綠色熒光蛋白GFP的表達量，從而測定轉染效率。具體方法為果蠅細胞 (3*105個/毫升)培養在35mm的培養皿中，加入1毫升的含5%FBS的果蠅培養基，在25. 5°C 條件下，昆蟲培養箱中培養M小吋。將5. 5微克的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯加入到200微升的含5%FBS的果蠅培養基中，混勻。將1微克質粒DNA加入另ー 200微升的含5%FBS的果蠅培養基中，混勻；然后將兩者混合，室溫靜置lh。處理果蠅細胞，吸去舊培養基，加入500微升新的含5%FBS的果蠅培養基。然后將石墨烯與DNA的混合物加入到培養基中，培養24h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達量，以及通過流式細胞儀，檢測綠色熒光蛋白的熒光強度，從而檢測轉染效率。對于檢測聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯對線性DNA的轉染效率，方法與轉染質粒DNA相同。結果顯示根據綠色熒光蛋白的熒光強度，可以看出G0-6NH2-PEG-2^-PEI轉染效率較高，在氮磷比為30吋，其質粒DNA轉染效率能達到70%左右，明顯高于PEI (11. 32%)，Lipofectamine 2000 (27. 32%)以及以及 Ef f ectene (34.68%)。對于線性 DNA 的轉染效率，G0-6NH2-PEG-25k-PEI (22. 24%)明顯優于其他兩個轉染試劑PEI (0. 56%)以及 Lipofectamine 2000 (2. 82%) 實施例3 研究實施例1中所得的聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的石墨烯對果蠅細胞的活性的影響
觀察實施例1中所得的聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯對果蠅細胞的細胞活性影響。具體方法是在96孔板上，每孔加入100微升的細胞培養液(3*104個/毫升)， 培養12小時。加入25微升的聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯(20. 5微克/毫升，12. 25微克/毫升，6. 125微克/毫升)，培養M小時。然后根據MTT法檢測細胞活性。結果如圖5所示可以觀察到，在6. 125微克/毫升的濃度條件下，相當于轉染時氮磷比30的濃度，聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯能使細胞保持93%左右的細胞活性，說明聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的生物安全性高。上述實施例只是為了說明本發明的技術構思及特點，其目的是在于讓本領域內的普通技術人員能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡是根據本發明內容的實質所作出的等效的變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯及其制備方法，包括氧化石墨烯、聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺，其特征在干，所述聚乙ニ醇為支鏈結構，6條支鏈的一端分別連接在葡萄糖分子的羥基上，另一端都為氨基；所述聚乙烯亞胺為支鏈結構；以所述氧化石墨烯、 聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺為原料，首先通過改進的Hummers方法制備氧化石墨烯，超聲處理5 分鐘后，向其中加入聚乙ニ醇并繼續超聲處理5分鐘，然后向其中加入EDC并繼續超聲處理 15分鐘，接著，向其中加入聚乙烯亞胺，超聲處理5分鐘后再向其中加入EDC，超聲處理20 分鐘，最后將反應在室溫下攪拌過夜或反應6小時，然后將反應完全的材料用100納米的濾膜抽濾洗3次，即可制備得聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，所述聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯的高度為Inm 2nm，尺寸為5nm 50nm。
2.根據權利要求1所述的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，其特征在干，所述聚乙ニ醇的分子量為10000，所述聚乙烯亞胺的分子量25000。
3.根據權利要求1所述的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯，其特征在干，所述聚乙ニ醇的質量百分比為洲士0. 5%,所述聚乙烯亞胺的質量百分比為37士3%。
4.權利要求1所述的聚乙ニ醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯在基因轉染方面的應用。
全文摘要
本發明提供一種聚乙二醇和聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯及其制備方法，包括氧化石墨烯、聚乙二醇和聚乙烯亞胺，所述聚乙二醇為支鏈結構，6條支鏈的一端分別連接在葡萄糖分子的羥基上，另一端都為氨基，所述聚乙二醇的數均分子量為10000；所述聚乙烯亞胺為支鏈結構，分子質量為25000；以所述氧化石墨烯、聚乙二醇和聚乙烯亞胺為原料，制備得高度為1nm～2nm，尺寸為5nm～50nm的聚乙烯亞胺和聚乙二醇修飾的氧化石墨烯。本發明聚乙烯亞胺和聚乙二醇修飾的氧化石墨烯能夠有效且安全將核酸輸送到細胞中，作為基因轉染試劑。
文檔編號C01B31/04GK102530935SQ201210004010
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者馮良珠, 劉莊, 張靜, 彭睿, 李述湯 申請人:蘇州大學