專利名稱：榆錢菠菜轉(zhuǎn)錄活性蛋白AhPHD1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種榆錢菠菜轉(zhuǎn)錄活性蛋白AhPHDl及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中物理、化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對植物的生長發(fā)育具有重要影響，嚴(yán)重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，因此培育耐逆性高的作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。目前，應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行育種已經(jīng)成為提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細(xì)胞具有多條途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的作用。現(xiàn)已在植物中發(fā)現(xiàn)了多類與植物耐逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，例如:EREBP/AP2中的DREB類，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)類具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白廣泛存在于動植物以及細(xì)菌、病毒蛋白中，比如哺乳動物的CBP類蛋白，人的INGl家族，酵母Yng2p蛋白，病毒MIRl蛋白。PHD類蛋白結(jié)構(gòu)域是C4HC3類的鋅指結(jié)構(gòu)，其功能主要為以下幾類:(I)作為乙酰化或去乙酰化酶參與染色質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；(2)作為E3泛素連接酶參與蛋白降解；(3)作為PIPs受體感知PIPs信號參與染色質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了 PHD類蛋白，植物中該類蛋白的功能研究尚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，名稱為AhPHDl,來源于榆錢菠菜(Atriplex hortensis),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由241個氨基酸殘基組成，屬于榆錢菠菜中的PHD家族。其編碼基因的讀碼框包含726個核苷酸。上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白AhPHDl的編碼基因AhPHDl也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述基因可為如下(I)或⑵或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
上述基因中的嚴(yán)格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2X SSC，0.1% SDS中漂洗；還可為:50°C，在7%SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5X SSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:501:，在7%505、0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗;也可為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS和I X SSC, 0.1% SDS各洗膜一次。其中，序列表中的序列I由726個脫氧核苷酸組成，本序列為AhPHDl基因的讀碼框，編碼具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有上述基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為將所述基因插入pBin438載體的BamH I和KpnI識別位點(diǎn)間得到的重組載體。擴(kuò)增所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對具體可為如下⑴或(II):(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對；(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對。所述蛋白、所述基因或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述應(yīng)用中，所述耐逆性具體為耐鹽性。
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本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的方法是將上述基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。上述方法中，該基因通過上述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中；上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；上述方法中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；在本發(fā)明的實(shí)施例中具體為擬南芥。上述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。將所述基因?qū)肽康闹参铮瑫顾龅鞍踪|(zhì)目的植物中合成，進(jìn)而是目的植物的耐逆性性狀得到改良。上述基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果:I)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達(dá)時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接。5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。在實(shí)際操作中，也可以將本發(fā)明基因進(jìn)行細(xì)胞靶向定位。可利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，將來源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。本發(fā)明的實(shí)驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個新蛋白 及其編碼基因AhPHDl，該基因的表達(dá)明顯受高鹽和低溫誘導(dǎo)，也受植物激素脫落酸ABA的誘導(dǎo)。將AhPHDl基因經(jīng)農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，導(dǎo)入擬南芥Col-O中，獲得了過量表達(dá)AhPHDl的純系株系，上述轉(zhuǎn)基因株系與野生型擬南芥相比，其耐鹽性有顯著提高，說明AhPHDl基因能夠顯著提高植物的耐鹽性。因此，本發(fā)明提供的蛋白AhPHDl對于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價值，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義；并且從分子生物學(xué)角度證明了 PDH家族中的一些成員確實(shí)參與植物對非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控，其表達(dá)與植物的耐非生物脅迫呈正相關(guān)。


圖1為AhPHDl基因在不同處理時的轉(zhuǎn)錄特征圖2為植物表達(dá)載體pBin438_AhPHDl的示意3為AhPHDl過表達(dá)株系的分子鑒定圖4為AhPHDl過表達(dá)株系與對照的耐鹽性鑒定
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實(shí)驗的平均值或平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。所有植物材料均生長于22°C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗)。pBin438載體(雙元表達(dá)載體)記載在(李太元，田穎川，秦曉峰,等.高效抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草的研究，中國科學(xué)(B輯)，1994，24 (3):276-282.)，由方榮祥院士惠賜。經(jīng)方榮祥先生同意，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。農(nóng)桿菌GV3101 菌株記載在 Clough-SJ, Bent-AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal.1998,16:6,735-743中，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-O):種子購自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下簡稱野生型擬南芥。實(shí)施例1、榆錢菠菜AhPHDl基因cDNA克隆1、榆錢菠菜AhPHDl基因的發(fā)現(xiàn)前期的研究表明具有轉(zhuǎn)錄活性的PHD蛋白家族參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，并與植物耐逆性相關(guān)。榆錢菠菜(Atriplex hortensis)又名山菠菜,是一種鹽生植物，參考擬南芥和大豆等物種PHD的保守氨基酸序列，設(shè)計一對簡并引物:AhHDFl: GYATHAAYTTYGCYAGRGATGG,AhHDRl:GCffGGDGTDATYTTMACACA,榆錢菠菜發(fā)芽,生長7天后分別以300mM NaCl水溶液處理0hr、5hr, IOhr,混合樣本，按照常規(guī)方法提取cDNA。以該cDNA為模板，應(yīng)用上述引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小在400bp左右的條帶，克隆到PMD18-T載體后測序，獲得4個不同的序列，用DNAStar Megal i gn軟件，與大豆PHD氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)相似度均在50%以上，且具有共同的保守結(jié)構(gòu)域，分別命名為 AhPHD1、AhPHD2、A hPHD3，AhPHD4。對其中的 AhPHDI 進(jìn)行了 進(jìn)一步研究。根據(jù)已獲得的部分cDNA序列各設(shè)計兩對巢式引物，采用Smart RACE的方法PCR擴(kuò)增cDNA的5’ -端和5’ -端序列，結(jié)果獲得了包括完整⑶S在內(nèi)的cDNA序列。Smart RACE 通用引物:SMART II Oligo (12 μ Μ):5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’3，-CDS (12 μ Μ):5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) 30V N_3’ (N = A, C, G, or T ；V = A, G, orC)再以下述引物經(jīng)RACE，克隆全長AhPHDl基因AhPHDlRACE 特異引物:SF1 (Specific forward primer for AhPHD I RACE):TAAGGACAAGCCTAGTGTGGATAGTG 194-NSFl(Nested specific forward primer for AhPHDIRACE):GGCAAGTGATGGGCAGATCAAGAG 248-SRl(Specific reverse primer for AhPHDIRACE):CTCTTGATCTGCCCATCACTTGCC -271NSRl(Nested specific reverse primer for AhPHDIRACE):CTATCCACACTAGGCTTGTCCTTAAC -217所克隆的序列包括ATG前面239bp，和終止密碼子TGA后的375bp。該基因的讀碼框架包括726bp，為AhPHDl的cDNA，為序列I中的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由241個氨基酸殘基組成。2、榆錢菠菜AhPHDl基因的獲得根據(jù)AhPHD I基因序列設(shè)計引物:
AhPHDlsense:5 ‘-ATGGAAGGAGGAACTGCGCAC-3，，(序列 3)AhPHDlantisense:5 ‘-CTAGGGTCGTGCTCTTTTGTT_3’(序列 4)應(yīng)用RT-PCR方法，從榆錢菠菜，又名山菠菜，(肖崗，張耕耘，劉鳳華，王軍，陳受宜，李聰，耿華珠，山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因研究，科學(xué)通報，1995,40 (8) =741-745,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)總RNA中擴(kuò)增AhPHDl基因，具體如下:取榆錢菠菜葉片，置于液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入無水乙醇進(jìn)行沉淀，最后將沉淀溶于水中得到總RNA。取5μ g總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)按試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。20 μ IPCR反應(yīng)體系為:1μ I 一鏈cDNA (0.05 μ g)、I μ I引物(AhPHDlsense、AhPHDl antisense:20 μ Μ)、2 μ I 10XPCR 緩沖液、0.4 μ I dNTP (IOmM)和 IU TaqDNA聚合酶，用超純水補(bǔ)足20 μ 1，液面覆蓋液體石蠟油。反應(yīng)在ΡΕ9600型PCR儀上進(jìn)行，其程序為 94°C變性 5min ;再 94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，共 30-32 個循環(huán)；然后 72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后序列分析，結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I的核苷酸序列，然后克隆于PMD18-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體pMDAhPHDl。3、AhPHDl基因在非生物脅迫下的表達(dá)特征對榆錢菠菜進(jìn)行聚乙二醇(PEG)模擬的干旱、NaCl, ABA和低溫處理，用于分析榆錢菠菜AhPHDl在非生物脅迫和脫落酸(ABA)處理下的轉(zhuǎn)錄特征。將榆錢菠菜種子種在盆中，生長2星期后，對幼苗分別進(jìn)行下述脅迫處理:生長條件除指明外均為22_23°C，光照16h/天。干旱處理: 將榆錢菠菜幼苗的根系置于20% (質(zhì)量百分含量)PEG溶液中，分別培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時、12小時和24小時后取樣。鹽處理:將幼苗的根系置于300mM NaCl水溶液中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時、12小時和24小時后取樣。ABA處理:將幼苗的根系置于100 μ MABA水溶液中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時、12小時24小時后取樣。低溫處理:將幼苗置于4°C培養(yǎng)箱中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時、12小時和24小時后取樣。應(yīng)用Real Time PCR分析AhPHDl基因在上述處理時的轉(zhuǎn)錄特征，總RNA的提取同實(shí)施例1。所用引物如下:QRT-AhPHD IF I:TATTTGCGAGAGGTGGTTCCQRT-AhPHD IR I:GCCCTGTCTTCTTCAAGCTG以Actin作為內(nèi)對照，引物為:QRT-AhactinFl:CTGCTGGTATCCACGAGACTQRT-AhactinRl:GCAATGCCAGGGAACATAGT結(jié)果如圖1所示，AhPHDl基因的轉(zhuǎn)錄明顯受脫落酸ABA誘導(dǎo)，分別在脅迫12小時和24小時時受低溫和高鹽誘導(dǎo)，受干旱誘導(dǎo)不明顯。植物激素ABA與植物與非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，因此上述結(jié)果表明AhPHDl可能參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答。
實(shí)施例2、AhPHDl編碼蛋白的功能1、重組表達(dá)載體pBin438_AhPHDl的構(gòu)建載體構(gòu)建引物:BamHI/Kpn IAhPHDlFl:GGATCCATGTCATCCTCAAATCCTCGAAC (序列 5)AhPHDlRl:GGTACCGTCGACTCAGTGACTACGCCCTGTC (序列 6)以實(shí)施例1獲得的pMDAhPHD I為模板，用限制性內(nèi)切酶BamHI和Kpn I雙酶切由AhPHDlFl和AhPHDlRl作為引物獲得的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切植物表達(dá)載體pBin438得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入pBin438的BamH I和KpnI酶切位點(diǎn)之間得到的載體，將該載體命名為pBin438_AhPHDl，且序列表中的序列I位于CaMV 35S啟動子之后。重組表達(dá)載體PBin438_AhPHDl結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。2、轉(zhuǎn)AhPHDl擬南芥株系的獲得將上述獲得的重組載體 pBin438-AhPHDl用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，測序，驗證該質(zhì)粒中的插入片段為AhPHDl，其讀碼框架無誤。將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為GV3101/pBin438-AhPHDl。挑取GV3101/pBin438-AhPHDl的單菌落在5mlLB中，于28°C培養(yǎng)8小時，再轉(zhuǎn)接到200mlLB中繼續(xù)培養(yǎng)3小時，收菌后重懸于LB培養(yǎng)基中得到轉(zhuǎn)化液。將野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)Col-O的花浸泡于轉(zhuǎn)化液中10秒，取出后放入MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)8小時，獲得Ttl代轉(zhuǎn)化種子，將其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培養(yǎng)基上，獲得25株Ttl代轉(zhuǎn)AhPHDl擬南芥。提取上述25株Ttl代轉(zhuǎn)AhPHDl擬南芥植株葉的RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行RT-PCR鑒定，以野生型擬南芥為對照，探針為:AhPHDlFl:TATTTGCGAGAGGTGGTTCCAhPHDlRl:GCCCTGTCTTCTTCAAGCTG結(jié)果如圖3所示，經(jīng)RT-PCR鑒定后，篩選2個Ttl代轉(zhuǎn)AhPHDl擬南芥作進(jìn)一步研究，命名為0X5和0X10，在0X5和0X10中AhPHDl均有較高的轉(zhuǎn)錄水平，而在對照野生型擬南芥Col-O中，未能檢測到AhPHDl的轉(zhuǎn)錄。將T1單株收獲種子，此為T2代種子，各單株種子分別播種，用卡那霉素繼續(xù)篩選以觀察T2代的分離情況，如此重復(fù)篩選，直至T3代獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，獲得穩(wěn)定遺傳的AtPHD6基因過表達(dá)株系0X5和0X10。采用同樣的方法，將空載體pBin438轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體擬南芥，按照上述方法進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果沒有目的產(chǎn)物，因此，得到陽性Ttl代轉(zhuǎn)空載體擬南芥，播種、收種，得到T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。3、轉(zhuǎn)AhPHDl擬南芥株系的耐鹽性鑒定實(shí)驗樣本如下(每個株系15粒種子):T3代轉(zhuǎn)AhPHDl基因植株(0X5和0X10兩個株系)、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥。將各個株系植株的種子同時播種在MS平板上，萌發(fā)后5天后將幼苗分別移栽到含有150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上生長14天，將NaCl處理14天后的幼苗移栽到蛭石中在正常條件下恢復(fù)生長25天。以正常生長(OmM NaCl)為對照處理。觀察鹽脅迫后恢復(fù)7天和25天比較表型，結(jié)果如圖4A和4B所示，其中，圖4A為移栽到含有150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上生長14天的結(jié)果，可以看出，150mM NaCl處理后的幼苗生長均受到嚴(yán)重抑制；圖4B為鹽脅迫后恢復(fù)7天(移栽后7天)和25天(移栽后25天)時野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的表型，可以看出，與OmM NaCl處理下，150mM NaCl處理后所有植株的生長均受到抑制，而野生型擬南芥較之T3代轉(zhuǎn)AhPHDl基因植株(0X5和0X10兩個株系)更為嚴(yán)重。統(tǒng)計恢復(fù)培養(yǎng)第25天野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的存活率，結(jié)果如圖4C所示，可以看出，野生型擬南芥(ColO)的存活率約為21%，而T3代轉(zhuǎn)AhPHDl基因植株的兩個株系0X5和0X10的存活率分別為44%和42%，明顯高于野生型擬南芥。T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無顯著差異。
上述結(jié)果表明，有榆錢菠菜AhPHDl參與了植物在高鹽脅迫下的調(diào)控，其編碼基因AhPHDl的過量表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的 氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入pBin438載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用；所述耐逆性具體為耐鹽性。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性高于所述目的植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于: 所述蛋白的編碼基因通過權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物； 所述耐逆性為耐鹽性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述雙子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種榆錢菠菜轉(zhuǎn)錄活性蛋白AhPHD1及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白命名為AhPHD1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗證明，該榆錢菠菜蛋白及其編碼基因可用于培育耐逆植物品種特別是耐鹽雙子葉植物品種。
文檔編號C07K14/415GK103204913SQ20121000989
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者張勁松, 陳受宜, 陶建軍, 張萬科, 林晴, 馬彪 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所