專利名稱：一種利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法
技術領域：
本發明涉及生物小分子提取純化技術領域，特別涉及一種利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法。
背景技術：
孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,縮寫PMSG)分子由 α及β亞基組成，α亞基由96個氨基酸組成，β亞基由149個氨基酸組成，分子量大致為39500 (決定于含糖量)，含糖量為45%左右，其中唾液酸為10. 8% 12. 1%，等電點PI2.6-2. 65，易溶于水，干燥時穩定。PMSG具備用于牲畜繁殖中促卵泡素及黃體生成素的雙重性質，對雌性動物可促進卵巢中卵泡發育及黃體生成，對雄性可促進睪丸精細管中精子生成及睪丸間質細胞分泌。
我國具有豐富的馬匹資源，采集50-120天的健康孕血，其中含高滴度的激素，提純后可用于動物繁殖、品種改良及生物技術研究方面，用途廣泛。隨著我國畜牧業由粗放型向集約化發展，特別是當前國家推廣的工廠化高效養殖中，PMSG在工廠化高效養羊(牛)配套技術中，用于超數排卵(可使單胎動物產雙胎或多胎)、同期發情(規模化生產中的關鍵技術)、同期受孕，大大提高生產效率，便于管理和操作，因此受到學術界和用戶的高度重視和歡迎，展現了極好的市場前景。既解決了因過度放牧而造成草場退化的生態環境保護問題，又實現了高效生產，用戶收益大幅度增加，兼顧了經濟效益和社會效益，保護了生態環境。
目前，現有的PMSG制備工藝需嚴格控制酸沉淀、鹽析、低溫酒精沉淀的各種提取參數，生產工藝繁瑣，勞動強度大，技術方法不夠先進，嚴重制約了 PMSG的生產和應用。如中國專利CN1872088A公開了一種獸用血促性素生產工藝，取孕馬血清用等量蒸餾水稀釋， 邊攪拌邊加固體硫酸銨，用濃氨水調ΡΗ，充分攪拌后，濾布過濾，清液滴加偏磷酸調pH，濾布過濾。清液經中空纖維超濾器濃縮，使體積濃縮至原體積的40 50%左右，緩慢加入預冷酒精，使40%乙醇沉淀，用濃氨水調pH，靜止分層后，虹吸上清，加預冷醫用酒精，用冰醋酸調ΡΗ，靜止分層后，虹吸法吸棄上清，剩余的部分混濁液離心取沉淀。將此沉淀用生理鹽水溶起，透析，酒精沉淀，沉淀物置干燥器中負壓抽氣至干燥。該工藝用到酸處理，多次使用乙醇，導致部分促性腺激素蛋白失活，且整個工藝流程較長，增加了促性腺激素蛋白丟失， 所以回收率較低(平均活性回收率為60%)。發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明的目在于建立一種基于抗體親和層析的高效孕馬血清促性腺激素純化方法，用于規模化生產孕馬血清促性腺激素。
本發明的目的是這樣實現的
—種利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法，包括如下步驟
(I)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體；
(2)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱；
(3)通過抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱純化孕馬血清促性腺激素。
所述的利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法，優選包括如下步驟
(I)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體用孕馬血清促性腺激素免疫BALB/ c小鼠，再用免疫鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的雜交瘤細胞，體內接種雜交瘤細胞，制備腹水，腹水離心除去細胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用protein A親和層析柱，或者辛酸-硫酸銨沉淀法純化出抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體；
(2)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱將步驟(I)所得抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體與活化的Sepharose2B或Sepharose4B連接,得免疫親和層析柱；
(3)通過抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱純化孕馬血清促性腺激素取孕馬血清，上樣所述免疫親和層析柱，依次用O. IM Na2HPO3,0. 15M NaCl，pH 7. 5 溶液洗去雜蛋白，用O. IM Tris-醋酸，2. OM NaCl，pH7. 7溶液洗脫并收集，收集液經O. OlM Na2HPO3,0. 15M NaCl，pH 7. 2溶液透析，過濾濃縮，得孕馬血清促性腺激素純品。
與現有技術相比，本發明涉及的孕馬血清促性腺激素生產方法具有如下優點和顯著進步
(I)免疫親和層析柱利用抗原抗體特異結合，有效排除雜蛋白，一次性提純孕馬血清促性腺激素，所得孕馬血清促性腺激素純度高(25001u/mg以上，FPLC測定只一個峰， SDS-PAGE測定一條帶)，質量好，收率高(90%以上)。
(2)條件溫和，蛋白質變性少。由于本發明不使用乙醇、酸溶液等潛在使孕馬血清促性腺激素變性的溶劑，因此能有效保護孕馬血清促性腺激素的天然狀態，蛋白質變性少。
(3)生產工藝簡單，生產成本低。雖然本發明用到較貴的ProteinA-Sepharose CL-4B,Sepharose2B,單克隆抗體制備技術等,但由于免疫親和層析柱可反復使用(使用25 次以上未出現明顯的柱效降低)，因此實際綜合成本降低。應用免疫親和層析一步就可得到孕馬血清促性腺激素，所以有效地減少了生產步驟，減少了廢水排放，有效減少了環境污染。
(4)有利于利用孕馬血清進一步開發其他產品。本發明以含有多種蛋白質及血液因子的馬血漿為原料，通過免疫親和層析純化技術獲得了高純度的孕馬血清促性腺激素后，剩余血清由于保持天然狀態，仍可用于其他血液因子提取，比如馬血清白蛋白的純化， 所以本發明顯著提高了原料利用價值。
具體實施方式
以下是本發明的具體制備例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。
本發明以孕馬血清為原料，用促性腺激素單克隆親和層析柱一次性分離純化出促性腺激素。親和層析柱制備采用常規小鼠免疫及單克隆抗體篩選技術，得到的單克隆抗體與活化的Sepharose2B、Sepharose4B連接制成免疫親和層析柱,孕馬血清通過親和層析柱后促性腺激素被吸附到親和層析柱上，然后經高鹽溶液洗脫，透析，一次性純化出促性腺激素。
實施例I利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素
A、制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體
(I)動物免疫
應用常規方法免疫BALB/c小鼠18_24g，多點皮下注射1000IU/ml的PMSG O. 3ml， 多次免疫后取眼球血做抗體滴度測定，從中選出產生高滴度(> I : 9000)抗體的小鼠用于雜交瘤制備。
(2)細胞融合
從免疫30天后的小鼠脾臟分離出脾細胞并與對數期骨髓瘤細胞SP2/0按4 I混合，加入50 % PEG6000處理45秒以促進融合形成雜交瘤細胞，處理后的細胞經稀釋后置于 HAT培養液中，鋪到96孔板及24孔板中，在含5% C02，37 °C條件下培養，融合7-8天后瓊脂單擴法篩選抗體生成孔，細胞經多次傳代后形成單克隆.
(3)雜交瘤細胞篩選
通過間接ELISA法篩選出產生高單位(滴度> I : 10000)，特異性強的單克抗體雜交瘤細胞株，保存于液氮中。
(4)動物免疫及大量抗血清制備方法
取BALB/c小鼠18_24g預先注入降值烷，7_10天后腹腔注入對數生長期的雜交瘤細胞Iml細胞濃度為7 X 106/ml，7-14天后待瘤細胞生長并分泌大量抗體形成腹水時收獲腹水，4000rpm離心5分鐘，去除細胞及雜質后得到抗血清。也可用連續體內雜交瘤細胞培養方法制備大量抗血清。即從小鼠體內得到腹水后，通過1200rpm離心7分鐘及加入細胞分離液的方法，從中分離出雜交瘤細胞，以2-4X 107/ml濃度注射小鼠腹腔Iml/只，7_14天后收獲腹水。每只小鼠可收到5-10ml腹水。
(5)抗體純化
收集的腹水離心(4000rpm，5分鐘)，除去細胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteinA親和層析柱,或者辛酸_硫酸銨沉淀法純化出抗促性腺激素IgG。一般腹水中 IgG 可達 O. 5 10mg/ml。
辛酸-硫酸銨沉淀法按以下流程進行
20ml腹水中加入40ml醋酸緩沖液0. 06M ρΗ5· O稀釋，用IM HCl調pH 4. 8，加入 660ul辛酸4°C處理2小時，15000g離心30分鐘得上清液，過濾后加入1/10體積的PBS然后用IM NaOH調ρΗ7· 2隨后加飽和硫酸銨至45%飽和度，沉淀I. 5小時，IOOOOrpm離心30 分鐘沉淀溶于 PBS ρΗ7· 2 (含 0. 137 MNaCl，2. 6MKC1，0. 2mMEDTA)，抗體溶液 PBS 透析， IOOOOrpm離心30分鐘，純化的IgG。
該法簡單易行,但對IgG3的回收率低,純化效果不如protein A親和層析。
protein A親和層析純化IgG法按以下流程進行
收集到的腹水經12000g離心15min得腹水上清液,然后過Protein A-Sepharose CL-4B柱(流速為lml/min), IgG結合到ProteinA-Sepharose CL-4B柱上，親和層析柱經20mM PBS,O. 15M NaCl, ρΗ7. O洗去雜蛋白后，結合的IgG經O. 02Μ, ρΗ4. O的檸檬酸緩沖液洗脫，抗體溶液立即用1Μ，P H 9. O的tris-HCl緩沖液調整pH值至7. 0，得到抗體IgG。
protein A親和層析純化法的優點是protein A-Sepharose CL-4B柱具有良好的再生性，其耐受低PH反復處理的性能極佳，純化后的單克隆抗體產率高，特異性強，且方法簡便快捷。Protein A-sepharose cl_4b凝膠可再生后反復使用10-20次以上。
(6) ProteinA-Sepharose CL-4B 再生
先用10倍柱體積O. IM pH8. 6 tris含O. 5M NaCl溶液洗脫柱；再用10倍柱體積含O. 5M NaCl的O. IM pH4. 5醋酸緩沖液洗柱；0. IM pH8. O PBS平衡，4°C貯存。
B、親和層析柱制備(處理Sepharose4B方法與Sepharose2B相同)
(I)活化親和層析柱
在燒杯中倒入Sepharose2B(Amersham公司)乙醇液200ml,先用蒸懼水洗漆10 次，每次300ml，每次洗滌后都用過濾器抽干，然后加200ml的O. 2M Na2CO3 pH8. 3溶液于 Sepharose2B中，于室溫滴加CNBr乙氰溶液6. 4ml，一分鐘加完，搖動反應5分鐘，快速過濾，去除 CNBr，活化后的 Sepharose2B 用 2000ml ImM HCl 洗，然后用 400ml O. ImM HCl 洗。
(2)抗體準備
從小鼠腹水收到并純化后的抗體IgG溶液經O. IM Na2C03/0. 5MNaClpH8. 3透析后， 再于4°C離心100，OOOg I小時得純化后的IgG溶液。
(3)抗體與親和層析柱連接
20ml IgG 溶液(5mg/ml)+200ml Sepharose2B 于 4°C攬祥過夜，然后加 O. 05M 甘氛酸溶液屏蔽S印harose2B上剩余的活性位點后，得親和層析柱200ml。
C、促性腺激素純化
將收集到的妊妊娠45-120天的健康牧養母馬血清2000ml，(ELISA測定效價為 50IU/ml)，加入200ml平衡后的親和層析柱內，設置流速為O. 5ml/min，取前，中，后段流出液測定是否有PMSG流失。待上樣完成后，用2000ml0. I M Na2HP03，0. 15M NaCl，pH 7. 5溶液洗去雜蛋白，214nM監測雜蛋白洗脫效果。然后用含O. IM Tris-醋酸，2. OM NaCl,pH7. 7 溶液400ml洗脫孕馬血清促性腺激素，把收集到的促性腺激素溶液放入透析袋在O. OlM Na2HP03 O. 15M NaCl,pH 7. 2溶液中透析過夜。最后促性腺激素溶液分裝成4ml/瓶，冷凍干燥后于低溫2-8°C保存。共收集到92瓶，每瓶效價為1000IU.總收率為92%。
權利要求
1.一種利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法，包括如下步驟 (1)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體； (2)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱； (3)通過抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱純化孕馬血清促性腺激素。
2.根據權利要求I所述的利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體用孕馬血清促性腺激素免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的雜交瘤細胞，體內接種雜交瘤細胞，制備腹水，腹水離心除去細胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用protein A親和層析柱，或者辛酸-硫酸銨沉淀法純化出抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體； (2)制備抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱將步驟(I)所得抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體與活化的Sepharose2B或Sepharose4B連接,得免疫親和層析柱； (3)通過抗孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的免疫親和層析柱純化孕馬血清促性腺激素取孕馬血清，上樣所述免疫親和層析柱，依次用O. IM Na2HP03,0. 15M NaCl，pH7. 5溶液洗去雜蛋白，用O. IM Tris-醋酸，2. OM NaCl，pH 7. 7溶液洗脫并收集，收集液經O. 01MNa2HP03，0. 15 M NaCl，pH 7. 2溶液透析，過濾濃縮，得孕馬血清促性腺激素純品。
全文摘要
本發明公開了一種利用單克隆抗體技術生產孕馬血清促性腺激素的方法，該方法以孕馬血清為原料，用促性腺激素單克隆親和層析柱一次性分離純化出促性腺激素，其中親和層析柱為采用常規小鼠免疫及單克隆抗體篩選技術，得到單克隆抗體與活化的Sepharose2B連接制成的親和層析柱，孕馬血清通過親和層析柱后促性腺激素被吸附到親和層析柱上，然后經高鹽溶液洗脫，透析，一次性純化出促性腺激素。本發明將免疫親和層析柱利用抗原抗體特異結合，有效排除雜蛋白，一次性提純孕馬血清促性腺激素，所得孕馬血清促性腺激素純度高，質量好，收率高。
文檔編號C07K1/22GK102924586SQ201210366478
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者王勇, 王秀麗, 高飛 申請人:內蒙古博格農牧業開發有限責任公司