本發(fā)明主要涉及胚胎工程技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用CRISPR/Cas9基因編輯方法構(gòu)建敲除p66^shc基因豬胚胎的方法。

背景技術(shù)：

早期胚胎的發(fā)育與培養(yǎng)環(huán)境中的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平有很大的關(guān)系。已有研究結(jié)果顯表明，過氧化氫的存在會誘導(dǎo)小鼠受精卵在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生周期性停滯、凋亡、壞死等生物學(xué)事件^[13]。輕微的氧化損傷最初導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜去極化，線粒體基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)線粒體分布改變；研究發(fā)現(xiàn)用H₂O₂處理48h后，受精卵皺縮，72h后發(fā)育停滯，出現(xiàn)DNA碎片，表明在胚胎發(fā)育的早期，氧化損傷線粒體致線粒體功能不良，可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡的主要原因^[13]。有研究表明，胚胎p66^shc(66-kilodahon isoform of Shc gene products)的表達(dá)與ROS水平有著密切的關(guān)系，而且研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)牛早期胚胎發(fā)育阻滯中胚胎中的p66^shc mRNA水平要顯著高于正常的胚胎^[10]。大約有14％左右的牛體外生產(chǎn)胚胎阻滯在分裂的2-4細(xì)胞階段，在這些阻滯的胚胎中發(fā)現(xiàn)有大量的ROS存在，主要以H₂O₂形式存在，這些ROS的產(chǎn)生及數(shù)量隨著在體外胚胎發(fā)育進(jìn)程而增加；相對于體內(nèi)胚胎，體外發(fā)育胚胎的ROS水平要高得多，產(chǎn)生的這些ROS會對胚胎產(chǎn)生不利的影響，會使得DNA鏈斷裂及蛋白的氧化水平提高等^[17,18]。已有研究也表明，產(chǎn)生的ROS水平能夠引起胚胎發(fā)生凋亡，影響胚胎體外發(fā)育的效率，同時研究表明p66^shc能夠識別由ROS引起的DNA破壞^[1]。為此，通過降低胚胎內(nèi)部p66^shc的表達(dá)，就能降低胚胎內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而提高豬胚胎體外發(fā)育效率。

眾所周知，CRISPR-Cas系統(tǒng)(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats-associated proteinsystems)是細(xì)菌及古細(xì)菌進(jìn)化出來用以抵御病毒和質(zhì)粒入侵的適應(yīng)性機(jī)制。CRISPR-Ca系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被應(yīng)用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細(xì)菌。多個科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases,TALEN)相比較，CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向?qū)嶒?yàn)在細(xì)胞或斑馬魚中顯示出相似甚至更高的效率。CRISPR-Cas9體系的RNA-DNA識別機(jī)制為選擇性基因組編輯提供了一個簡便而強(qiáng)大的工具。在實(shí)際應(yīng)用中，CRISPR/Cas系統(tǒng)通常會把兩個編碼trancRNA與crRNA的基因結(jié)合成一個單鏈向?qū)NA(sgRNA)，即現(xiàn)在運(yùn)用的CRISPR/Cas系統(tǒng)主要是由Cas9蛋白和sgRNA組成。該體系其中一個最重要的優(yōu)勢是Cas9蛋白可在多個不同的sgRNA(small guide RNA)的引導(dǎo)下同時修飾多個基因組靶點(diǎn)。

基于上述的思路，本發(fā)明利用CRISPR/Cas9基因編輯方法在胚胎早期(原核注射方法)，敲除掉p66^shc基因，降低胚胎的ROS表達(dá)，通過篩選陽性胚胎，進(jìn)行后續(xù)的研究性工作，從而最終建立高效的豬胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在構(gòu)建一種的敲除p66^shc基因豬胚胎生產(chǎn)體系，降低體外胚胎培養(yǎng)過程中的ROS水平，從而通過減少體外培養(yǎng)過程中的損傷等，提高豬胚胎體外生產(chǎn)的效率，最終構(gòu)建有效的豬胚胎體外生產(chǎn)體系。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種利用CRISPR-Cas9基因編輯方法敲除主胚胎中p66^shc的方法，具體的操作步驟如下：

(1)設(shè)計(jì)Oligo DNA序列

在p66^shc基因的表達(dá)DNA區(qū)域中設(shè)計(jì)一對20bp左右的oligo DNA，可以通過在線工具設(shè)計(jì)。按照得分優(yōu)先選擇1-3對的Oligo合成。另外，需在位點(diǎn)上下游各設(shè)計(jì)一條引物，用于后續(xù)PCR或測序檢測陽性克隆，引物能擴(kuò)增約300bp的DNA片段，上游引物距突變位點(diǎn)約100bp，下游引物距突變位點(diǎn)約200bp。將設(shè)計(jì)后的序列送到值得信賴的公司合成，純化級別為PAGE，準(zhǔn)備進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

(2)Oligo的連接

將合成的2條單鏈Oligo DNA稀釋至1μg/μl后，退火形成雙鏈DNA，再與載體連接。pGLKO(Genloci公司購買)是線性載體，無需酶切處理，可直接用于T4 DNA連接酶連接反應(yīng)。

(3)構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增

將上述產(chǎn)物按照常規(guī)分子克隆技術(shù)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，挑取陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，大量提取質(zhì)粒，得到構(gòu)建好的包含敲除p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的表達(dá)質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證敲除效率

首先解凍培養(yǎng)293T細(xì)胞，待生長培養(yǎng)傳代2次后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。共轉(zhuǎn)染前提，稀釋至質(zhì)粒濃度為1μg/μl，轉(zhuǎn)染前48小時，接種細(xì)胞至備用生產(chǎn)慢病毒的孔板或是培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞匯合度約為70％-80％為最佳感染狀態(tài)，活力≥95％以上。以轉(zhuǎn)染時間為起始點(diǎn)，一次收獲時間為24h后收獲上清，保存于4℃下，如長期保存則在-84℃下。接種適量靶細(xì)胞，加入上述收集的含有質(zhì)粒的病毒顆粒溶液，混勻。將靶細(xì)胞有限稀釋后，分到96孔板中進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，待細(xì)胞長好后，取1000個左右的細(xì)胞，提基因組。然后使用T7核酸內(nèi)切酶初步篩選陽性克隆，并且對篩選后的陽性克隆進(jìn)行測序分析，并對堿基缺失結(jié)果進(jìn)行比對分析，從而可以驗(yàn)證該p66^shc基因CRISPR-Cas9系統(tǒng)的有效性。

(5)p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建

設(shè)計(jì)好上述質(zhì)粒上Cas9的引物，試劑盒mMESSAGEmMACHINE Ultra Kit(Ambion)其擴(kuò)增上述得到的Cas9 mRNA，同時用設(shè)計(jì)好的引物利用試劑盒MEGAshortscript(Ambion)擴(kuò)增gRNA的序列。得到PCR產(chǎn)物后分別用1.5％凝膠進(jìn)行電泳，辨認(rèn)其得到的片段大小。得到p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)mRNA后，保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)豬p66^shc基因敲除胚胎生產(chǎn)

把構(gòu)建好的豬胚胎，在受精后17h進(jìn)行胞質(zhì)注射上述p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)mRNA，按照濃度為10ng/ul，其每個胚胎注射的總量為3ul。在培養(yǎng)后，利用后續(xù)的系統(tǒng)檢驗(yàn)該基因的敲除效果，評價其敲除效率。

(7)p66^shc基因敲除結(jié)果驗(yàn)證

PCR克隆囊胚后的p66^shc基因DNA序列(一般產(chǎn)物在0.5-1K為好)，其引物設(shè)計(jì)注意得到的產(chǎn)物的突變位點(diǎn)不要位于中間比較好，利用T7內(nèi)切酶酶切后，凝膠電泳分析，確認(rèn)其是不是已經(jīng)敲除。同時，還可以結(jié)合利用PCR產(chǎn)物測序后對比分析得出結(jié)論。

附圖說明

圖1為通過篩選獲得三對p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的Oligo引物。

圖2為試驗(yàn)中涉及的載體結(jié)構(gòu)圖，用于鏈接gRNA和表達(dá)用于胚胎注射的mRNA合成模板序列。

圖3為驗(yàn)證其構(gòu)建p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的敲除效率的酶切示意圖。

具體實(shí)施方式

(1)設(shè)計(jì)Oligo DNA序列

首先，在豬流產(chǎn)胎兒組織中提取總的DNA，通過設(shè)計(jì)p66^shc基因的上游引物和反向的下游引物PCR克隆p66^shc基因全長，然后進(jìn)行DNA測序，保存序列，分析其啟動子區(qū)域備用。接著，在p66^shc基因的表達(dá)DNA區(qū)域中設(shè)計(jì)一對20bp左右的oligo DNA，可以通過以下在線工具設(shè)計(jì)：麻省理工學(xué)院的CRISPR Design (http://crispr.mit.edu/)或德國癌癥研究中心的E-Crisp(www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)。按照得分優(yōu)先選擇1-3對的Oligo合成。通過在線設(shè)計(jì)，選擇得到如下較好的3對Oligo:

(1).TCAATAAGCCCACGCGGGGCTGG

(2).CCGGGGTTTCCTACTTGGTTCGG

(3).GCGAGGAGTGGACCCGCCACGGG

由此按照連接質(zhì)粒的要求，分別換成以下3對引物

(1)p66^shc-F:5’…accgGTCAATAAGCCCACGCGGGGC…3’

p66^shc-R:5’…aaacGCCCCCGCGTGGGCTTATTGAC…3’

(2)p66^shc-F:5’…accgGCCGGGGTTTCCTACTTGGTT…3’

p66^shc-R:5’…aaacGAACCAAGTGGAAACCCCGGC…3’

(3)p66^shc-F:5’…accgGCGAGGAGTGGACCCGCCACG…3’

p66^shc-R:5’…aaacGCGTGGCGGGTCCACTCCTCGC…3’

將設(shè)計(jì)后的序列送到值得信賴的公司合成，純化級別為PAGE，準(zhǔn)備進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

(2)T4 DNA Ligase連接

將合成的2條單鏈Oligo DNA稀釋至1μg/μl后，退火形成雙鏈DNA，再與載體連接。pGLKO線性載體，無需酶切處理，可直接用于T4 DNA連接酶連接反應(yīng)，退火反應(yīng)體系如下：

將以上體系瞬時離心后，置于PCR儀中95℃孵育3min，孵育后自然冷卻20min。取1.75μl的雜交后的雙鏈DNA進(jìn)行T4連接酶連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

(3)構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增

將上述產(chǎn)物按照常規(guī)分子克隆技術(shù)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，其具體操作過程如下：在LB平板上挑取DH5α的單個菌落接種于3.0mL LB液體培養(yǎng)基中，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)；次日按2％的體積接種于新的LB培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)3～4h至OD600＝0.3～0.5；將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至1.5mL的滅菌離心管中，每管1.0mL，冰浴30min；4℃12000rpm離心30s；完全棄去上清，用1.0mL 0.1mol/L冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，冰浴10min；4℃12000rpm離心30s；完全棄上清，用100μL 0.1mol/L冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，放置4℃冰箱24h內(nèi)備用。取質(zhì)粒1.0μL(適量)加入到100μL新鮮制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后置42℃水浴中熱休克90s，迅速置冰中冷卻1～2min；每管加入預(yù)熱的800μL LB培養(yǎng)基，37℃200rpm震蕩培養(yǎng)45min；取100μL菌液，然后涂布于相應(yīng)抗性平板上，37℃培養(yǎng)16～24h。

篩選陽性克隆，挑取陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，大量提取質(zhì)粒，具體的操作步驟如下：挑取外源基因與載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化所涂布抗性平板上的單個菌落，接種于3.0mL的含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)。取1.5mL菌液，12000rpm離心30s，沉淀菌體；完全棄去上清后加入300μL 4℃預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris-Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA)重懸細(xì)菌；加入新配制的溶液II 300μL(0.2mol/L NaOH；1％SDS)，快速顛倒離心管5次，將離心管置于冰上；加入225μL用冰預(yù)冷的溶液III(5mol/L乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL)，蓋緊管口，將管倒置后溫和顛倒至蛋白變性成白色團(tuán)塊，置冰上3～5min；4℃12000rpm離心5min，將上清移至新的離心管中；加入等體積的酚∶氯仿，顛倒混勻后置室溫5min，12000rpm離心5min；取上清到新的離心管，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min；12000rpm離心l0min，棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀一次，干燥，加入30μL的TE(pH8.0)或雙蒸水溶解；加入1μL RNase A(10mg/mL)，37℃作用30min。

得到構(gòu)建好的包含敲除p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的表達(dá)質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證敲除效率

首先解凍培養(yǎng)293T細(xì)胞，待生長培養(yǎng)傳代2次后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。共轉(zhuǎn)染前提，稀釋至質(zhì)粒濃度為1μg/μl，轉(zhuǎn)染前48小時，接種細(xì)胞至備用生產(chǎn)慢病毒的孔板或是培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞匯合度約為70％-80％為最佳感染狀態(tài)，活力≥95％以上。其具體操作過程如下：

(1).加入800ul 0.25％胰酶消化大概30s，隨時觀察細(xì)胞形態(tài)，消化結(jié)束，加入2倍胰酶體積的完全培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻；

(2).5℃，900rpm，離心5min，去上清；

(3).加入1ml PBS，重懸后，25℃，900rpm，離心5min，去上清，重復(fù)此步驟1-2次；

(4).加入200ul無血清的培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，各加入5μl pGLKO線性載體(Genloci公司)和Packaging Mix(Genloci公司)；

(5).離心過程中，可準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)設(shè)備，開通電源，移液槍吸取200ul的細(xì)胞懸液至電極管中(保證不要出現(xiàn)起泡)，按照1200V，20ms，2次脈沖的電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)；

(6).電轉(zhuǎn)結(jié)束，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的孔板或是培養(yǎng)皿中，加入適量的含血清濃度為2％～10％的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

以轉(zhuǎn)染時間為起始點(diǎn)，一次收獲時間為24h后收獲上清，保存于4℃下，如長期保存則在-84℃下。接種適量靶細(xì)胞，加入上述收集的含有質(zhì)粒的病毒顆粒溶液，混勻。將靶細(xì)胞有限稀釋后，分到96 孔板中進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，待細(xì)胞長好后，取1000個左右的細(xì)胞，提基因組。然后使用T7核酸內(nèi)切酶初步篩選陽性克隆，并且對篩選后的陽性克隆進(jìn)行測序分析，并對堿基缺失結(jié)果進(jìn)行比對分析，從而可以驗(yàn)證該p66^shc基因CRISPR-Cas9系統(tǒng)的有效性。

(5)p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建

設(shè)計(jì)好上述質(zhì)粒上Cas9的引物，試劑盒mMESSAGEmMACHINE Ultra Kit(Ambion)其擴(kuò)增上述得到的Cas9 mRNA，同時用設(shè)計(jì)好的引物利用試劑盒MEGAshortscript(Ambion)擴(kuò)增gRNA的序列。得到PCR產(chǎn)物后分別用1.5％凝膠進(jìn)行電泳，辨認(rèn)其得到的片段大小。得到p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)mRNA后，保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)豬合子胚胎注射

把構(gòu)建好的豬胚胎，在受精后17h進(jìn)行胞質(zhì)注射上述p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)mRNA，按照濃度為10ng/ul，其每個胚胎注射的總量為3ul。并且按照CRISPR-Cas9系統(tǒng)胚胎組、注射緩沖胚胎組和不注射胚胎組三組進(jìn)行對比性注射。注射完成后，培養(yǎng)4-6小時，觀察胚胎的存活情況，選擇質(zhì)量良好的胚胎進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)，培養(yǎng)6天后觀察。

(7)胚胎發(fā)育效率比較

注射p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)胚胎組、注射緩沖胚胎組和不注射胚胎組(對照組)在體外進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。在胚胎培養(yǎng)液洗2～3遍后轉(zhuǎn)入25μL微滴中，上蓋礦物油，每滴1-2枚胚胎，38.5℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)。44～48h后記錄卵裂數(shù)，分別在第6和7天時記錄桑椹胚和囊胚數(shù)，觀察不同組別的卵裂率，囊胚胎率等指標(biāo)。

(8)p66^shc基因敲除結(jié)果驗(yàn)證

選擇發(fā)育到囊胚的胚胎通過吸取滋養(yǎng)層5-10個細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測p66^shc基因是不是表達(dá)，同時計(jì)算其敲除的效率。PCR克隆囊胚后的p66^shc基因DNA序列(一般產(chǎn)物在0.5-1K為好)，其引物設(shè)計(jì)注意得到的產(chǎn)物的突變位點(diǎn)不要位于中間比較好，利用T7內(nèi)切酶酶切后，凝膠電泳分析，確認(rèn)其是不是已經(jīng)敲除。同時，還可以結(jié)合利用PCR產(chǎn)物測序后對比分析得出結(jié)論。

下表為p66^shc基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的Oligo引物設(shè)計(jì)

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