1.基因甲基化檢測方法,其特征在于:針對目的基因設計目的基因甲基化正義鏈的引物對和目的基因甲基化反義鏈的引物對,以及設計檢測目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針,所述目的基因甲基化正義鏈的引物對為目的基因甲基化正義鏈的正向引物和目的基因甲基化正義鏈的反向引物,所述目的基因甲基化反義鏈的引物對為目的基因甲基化反義鏈的正向引物和目的基因甲基化反義鏈的反向引物,所述目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針分別為目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針。
2.根據權利要求1所述的基因甲基化檢測方法,其特征在于,所述的目的基因為septin9基因,所述septin9甲基化位點為啟動子區的CpG島,序列為轉錄起始位點上游的-670~-555bp區。
3.根據權利要求2所述的基因甲基化檢測方法,其特征在于,
所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1:
5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’
所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2:
5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3:
5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4:
5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’。
4.根據權利要求3所述的基因甲基化檢測方法,其特征在于,
所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5:
5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’
所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6:
5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。
5.根據權利要求4所述的基因甲基化檢測方法,所述目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM,所述目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1。
6.根據權利要求5所述的基因甲基化檢測方法,其特征在于,使用內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針,所述內參基因為ACTB,
所述內參基因引物序列如SEQ No.7:
ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’,
所述內參基因引物序列如SEQ No.8:
ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’,
所述內參基因甲基化探針序列如SEQ No.9:
ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。
7.根據權利要求6所述的基因甲基化檢測方法,其特征在于,所述方法步驟為:
A、從待測樣本中提取DNA,
B、對提取的DNA進行硫化轉化修飾,
C、對修飾后的DNA進行純化,得到樣本模板,
D、將所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物、目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針、內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針以及所述樣本模板同時加到同一孔中進行PCR擴增反應。
E、計算目的基因正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值。
8.根據權利要求7所述的基因甲基化檢測方法,所述PCR擴增反應體系的終濃度組成為:1~10×PCR緩沖液、0.1~1mM dNTPs、0.1~1uM目的基因甲基化正義鏈的引物對、0.1~1uM目的基因甲基化反義鏈的引物對、0.05~2ng/ul模板DNA、0.1~1uM目的基因甲基化正義鏈探針、0.1~1uM目的基因甲基化反義鏈探針、0.01~0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1~5mM氯化鎂,0.1~1uM內參基因甲基化引物對,0.1~1uM內參基因甲基化探針。
9.根據權利要求1所述的基因甲基化檢測方法,其特征在于,所述目的基因為HOXA9基因,
所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10:
5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’
所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11:
5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12:
5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13:
5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’
所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14:
5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’
所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15:
5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’。
10.直腸癌檢測方法,其特征在于,使用權利要求1~8所述的方法檢測目的基因甲基化程度判斷是否患有直腸癌。
11.基因甲基化檢測試劑盒,其特征在于,包含目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物、目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針。
12.根據權利要求11所述的基因甲基化檢測試劑盒,其特征在于,所述的目的基因為septin9基因,
所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1:
5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’
所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2:
5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3:
5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4:
5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’;
所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5:
5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’
所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6:
5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。
13.根據權利要求11所述的基因甲基化檢測試劑盒,其特征在于,所述目的基因為HOXA9基因,
所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10:
5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’
所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11:
5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12:
5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’
所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13:
5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’
所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14:
5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’
所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15:
5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’。
14.根據權利要求12或13所述的基因甲基化檢測試劑盒,其特征在于,所述目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM,所述目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1。
15.基因甲基化檢測試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包含內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針,所述內參基因為ACTB,
所述內參基因引物序列如SEQ No.7:
ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’,
所述內參基因引物序列如SEQ No.8:
ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’,
所述內參基因甲基化探針序列如SEQ No.9:
ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。
16.權利要求12所述的基因甲基化檢測試劑盒的應用,其特征在于,所述基因甲基化檢測試劑盒用于直腸癌檢測。