本發明涉及微生物應用與飼料加工生產領域，具體而言，涉及一種枯草芽孢桿菌及其分離方法與應用。
背景技術：
：隨著人們生活水平的提高和對健康的日益重視，食品安全也越來越受到大家的重視。作為動物性食品的供應者，畜牧業在維護食品安全方面具有重要作用。在我國養殖業中，抗生素的過度使用，造成了藥物殘留以及大量耐藥性細菌產生，其結果嚴重阻礙了畜、禽、水產養殖業的健康持續發展，為食品安全和消費者的身體健康埋下了隱患，因此尋找安全、無殘留的抗生素替代品迫在眉睫。包含益生菌的生物飼料添加劑是一種十分理想的部分抗生素的替代品，其中益生菌是開發質量穩定、效果顯著、性價比高的生物飼料添加劑的重要基礎。但是益生菌的研究和開發的關鍵問題在于優良菌株的分離和篩選、良好的益生菌處理工藝。目前，益生菌菌種存在以下幾個問題：1.大多數的益生菌為不產芽孢的乳酸菌，且多屬專性厭氧菌，極易受到溫度、氧氣、水分及酸堿等外界環境因素的影響，通常益生菌活性保持比較困難；2.多數益生菌在飼料加工過程中難以耐受飼料制粒時的高溫；3.菌種本身的特性不好，產酶、抑菌能力差。益生菌在養豬業和家禽養殖中的應用比較廣泛，且飼用效果也得到廣泛的驗證和肯定。而微生物制劑在反芻動物營養與飼料中的應用的研究較少，尤其是微生物益生菌在鹿的營養飼料中的應用研究更為少見。技術實現要素：本發明的第一目的在于提供一種枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12484。本發明的第二目的在于提供上述的枯草芽孢桿菌的生物學純培養物。本發明的第三目的在于一種上述的枯草芽孢桿菌的分離方法，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理鹽水，振蕩混勻，加熱后梯度稀釋，得到梯度稀釋液，利用傾注培養法分離培養梯度稀釋液，采用平板劃線法純化菌種，得到枯草芽孢桿菌。本發明的第四目的在于提供上述的枯草芽孢桿菌在制備菌劑或飼料中的應用。本發明的第五目的在于提供上述的枯草芽孢桿菌在飼養偶蹄目動物中的應用，上述枯草芽孢桿菌能增加偶蹄目動物胃液中纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一種的含量。本發明的第六目的在于提供一種菌劑，其包括上述的枯草芽孢桿菌。本發明的第七目的在于提供一種飼料，其包括上述的枯草芽孢桿菌。本發明的第八目的在于提供上述的菌劑在飼養偶蹄目動物中的應用。為了實現本發明的上述目的，采用以下技術方案：一種枯草芽孢桿菌，分類命名：枯草芽孢桿菌bacillussubtilis；于2016年05月20日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12484。上述的枯草芽孢桿菌的生物學純培養物。上述的枯草芽孢桿菌的分離方法，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理鹽水，振蕩混勻，加熱后梯度稀釋，得到梯度稀釋液，利用傾注培養法分離培養梯度稀釋液，采用平板劃線法純化菌種，得到枯草芽孢桿菌。上述的枯草芽孢桿菌在制備菌劑或飼料中的應用。上述的枯草芽孢桿菌在飼養偶蹄目動物中的應用，上述枯草芽孢桿菌能增加偶蹄目動物胃液中纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一種的含量。一種菌劑，包括上述的枯草芽孢桿菌。一種飼料，包括上述的枯草芽孢桿菌。上述的菌劑在飼養偶蹄目動物中的應用。與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明提供一種枯草芽孢桿菌，分類命名：枯草芽孢桿菌bacillussubtilis；于2016年05月20日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12484；該枯草芽孢桿菌能有效的增加偶蹄目動物胃液中纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一種的含量，將上述的枯草芽孢桿菌應用于制備菌劑或者飼料，能較好的提高經濟動物飼養過程中飼料利用率低，生長慢的問題；上述菌劑或者飼料能使偶蹄目動物飼料利用率提高，達到快速生長地目的。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。在本發明實施例中提供的菌株，該菌株的分類命名為枯草芽孢桿菌，拉丁文學名為bacillussubtilis，于2016年05月20日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12484。本發明實施例中提供的菌株的形態學特征如下：枯草芽孢桿菌呈桿狀，為革蘭氏陽性。本發明實施例中提供的菌株主要生理生化特征如下：具有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，且還具有耐酸和耐膽鹽的特性，能耐受較多的化學物質；可利用碳源來源豐富。本發明實施例中提供的菌株的培養特征如下：普通lb固體培養基，37℃條件下培養。本發明實施例中提供的菌株的代謝特征如下：可調整菌群失調達到治療目的，可促使機體產生抗菌活性物質、殺滅致病菌。能產生抗活性物質，并具有獨特的生物奪氧作用機制，能抑制致病菌的生長繁殖。枯草芽孢桿菌促進飼料中營養素降解，適用于細菌原因引起的腸道菌群失調癥以及腸道需要保健的養殖動物。對家禽類動物效果比較顯著，如雞、鴨、鵝等，豬、牛、羊等動物配方枯草芽孢桿菌使用效果更佳。枯草芽孢桿菌是我國農業部批準使用的飼料級菌株之一。具有菌體繁殖速度快、容易培養、抗逆性強、耐高溫、耐酸堿、耐擠壓，且能分泌多種酶及氨基酸，所以其產品應用范圍廣，特別是在醫藥畜牧業中具有較高的應用價值。下面對本發明實施例的一種枯草芽孢桿菌及其分離法與應用進行具體說明。一種枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12484。該枯草芽孢桿菌的保藏信息：分類命名：枯草芽孢桿菌bacillussubtilis；于2016年05月20日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12484。上述的枯草芽孢桿菌的生物學純培養物。枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌。上述的枯草芽孢桿菌的分離方法，其包括：取梅花鹿瘤胃液，加入生理鹽水，振蕩混勻，加熱后梯度稀釋，得到梯度稀釋液，利用傾注培養法分離培養梯度稀釋液，采用平板劃線法純化菌種，得到枯草芽孢桿菌。動物的腸胃中含有大量的菌群，其中有很多的益生菌，包括枯草芽孢桿菌；本發明從梅花鹿的胃液中提取分離枯草芽孢桿菌，作為動物源的益生菌，能更好的適應在經濟動物尤其是反芻動物使用中的應用；枯草芽孢桿菌通過分泌纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶等，幫助反芻動物降解飼料中的大量纖維素，淀粉等，增加飼料的可吸收性，達到快速增肥飼養動物的目的。上述的枯草芽孢桿菌在制備菌劑或飼料中的應用。將具有生物活性的枯草芽孢桿菌，應用于制備飼養經濟動物的益生菌菌劑或飼養用飼料，具有較好的經濟價值和社會價值。上述的枯草芽孢桿菌在飼養偶蹄目動物中的應用，枯草芽孢桿菌能增加偶蹄目動物胃液中纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一種的含量。枯草芽孢桿菌通過增加動物胃液中的纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一種的含量；通過酶的作用提高對胃液中的飼料等進行作用，提高動物胃液中營養物質的含量，并提高動物的消化吸收能力，達到增肥動物的目的。一種菌劑，其包括上述的枯草芽孢桿菌。菌劑可以有多種存在狀態，可以是枯草芽孢桿菌的菌液，也可以是菌的純培養物；當然用途也多種多樣；枯草芽孢桿菌的種子菌液可以用大規模培養枯草芽孢桿菌，應用于生產。一種飼料，其包括上述的枯草芽孢桿菌。將枯草芽孢桿菌應用于制備飼料，能提高飼養動物的消化吸收能力，達到提高經濟效益的目的。上述的飼料在飼養偶蹄目動物中的應用。進一步地，偶蹄目動物為反芻亞目的動物。進一步地，反芻亞目動物為梅花鹿。以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供枯草芽孢桿菌的分離與鑒定，具體操作如下：1.1取梅花鹿的瘤胃液20g，加入到100ml的無菌生理鹽水中；1.2搖床震蕩30min，充分溶解混勻；1.3在85℃水浴15min，按照0、10、102、103、104、105、106、107、108和109一共10個梯度，進行稀釋；1.4采用傾注培養法分離培養菌液，在37℃條件下培養48h；1.5用接種環挑取枯草芽胞桿菌單斑，采用平板劃線法的方式，接種于平板，進行純化培養；1.6重復步驟1.5的操作，連續純化4代，獲得枯草芽胞桿菌及枯草芽胞桿菌的生物學純培養物。經過對純化獲得的枯草芽胞桿菌進行形態學觀察發現；枯草芽胞桿菌菌落規則，邊緣整齊有毛邊，中心突出，質地均勻；菌落呈乳白色。經革蘭氏染色，枯草芽胞桿菌為桿狀革蘭氏陽性菌。實施例2本實施例提供一種枯草芽孢桿菌，分類命名：枯草芽孢桿菌bacillussubtilis；于2016年05月20日在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.12484。實施例3本實施例提供一種菌劑和飼料，該菌劑和飼料包括實施例2提供的枯草芽孢桿菌。該菌劑的制備方法如下：1.1配制枯草芽孢桿菌的發酵培養基，配方為：紅糖1.8％(m/v)、玉米粉1％(m/v)，豆柏2.4％(m/v)，檸檬酸銨1.8％(m/v)、混合鹽溶液0.6％(v/v)、消泡劑0.08％(v/v)，按比例配成發酵培養基；1.2然后調節ph為7.2，經121℃高溫蒸汽消毒20min；1.3降溫至37℃時，向發酵培養基中接種菌齡20h的種子液3.5％(v/v)；1.4在37℃條件下，保持轉速250rpm攪拌，發酵培養18h，放罐，得到枯草芽孢桿菌活菌數為1.39×1011cfu/ml。向發酵罐中加入保護劑(甘油0.8％，谷氨酸鈉0.2％和玉米淀粉19％)，再經干燥的得到枯草芽孢桿菌菌劑。將獲得的含有枯草芽孢桿菌的菌劑加入到飼料的預混料中，制成飼養用的飼料。實驗例1本實驗例提供了對實施例2提供的枯草芽孢桿菌的安全性實驗。本實驗例采用小鼠灌胃實驗，進行安全性實驗，具體方法如下：1.1枯草芽孢桿菌濃度為凍干粉，經平板計數法計數，凍干粉細菌數為5×1014cfu/g；1.2選用適應飼養2周后的8周齡左右72只大小均勻雌性小鼠，用專用無抗鼠食；1.3隨機分成4組(ⅰ組為對照組灌服無菌生理鹽水，ⅱ組按照5×1011cfu/只的量灌服枯草芽孢桿菌，ⅲ組按照5×109cfu/只的量灌服枯草芽孢桿菌，ⅳ組按照5×107cfu/只的量灌服枯草芽孢桿菌，每組3個重復，每個重復6只；1.4每日上午9：00灌胃小鼠一次，連續灌服21天。所有試驗鼠試驗室溫控制為21±3℃，相對濕度為50-70％，正常光照，飼喂標準小鼠飼料，自由飲水，墊料為刨木花，每3天清掃鼠籠一次。試驗期間，每天觀察并記錄實驗過程中小鼠的體征、功能代謝、中毒表現及死亡情況，小白鼠臨床癥狀有無異常。檢測指標：于試驗正式期的每3天早上9：00稱量小鼠飼料消耗量，實驗前后稱量小鼠體重；試驗開始和結束當天從每組隨機選取5只試驗鼠，用雙手輕輕擠壓小鼠腹部，取糞樣，裝在5ml離心管，加甘油保存，用于pcr-dgge微生物區系分析；血清的準備：于試驗結束當天每組隨機選5只試驗鼠頸動脈取血1.5ml左右，放入2ml離心管，放置在促凝管中，在低溫高速離心機4℃、2000rpm/min，離心10min，分離血清，另取1.5ml離心管用于裝血清，保存在-20℃冰箱待檢測用。檢測指標：血清中白蛋白alb、總蛋白tp、高密度脂蛋白hdl、低密度脂蛋白總脂ldl、膽固醇cho、堿性磷酸酶alp、白細胞介素6、腫瘤壞死因子，并對樣品進行檢測；取完整的肝臟、胸腺、脾臟和兩側腎臟并稱濕重，分別計算肝臟指數(肝臟濕重/體重)、和胸腺指數(胸腺濕重/體重)、脾臟指數(脾臟濕重/體重)和腎臟指數(雙腎濕重/體重)。表1枯草芽孢桿菌的安全性實驗第ⅰ組第ⅱ組第ⅲ組第ⅳ組7天存活存活存活存活14天存活存活存活存活21天存活存活存活存活表2臟器指數第ⅰ組第ⅱ組第ⅲ組第ⅳ組心臟指數0.55580.56860.56070.5832肝臟指數5.19184.90885.06995.1694脾臟指數0.39220.40190.36660.4080腎臟指數1.49941.50851.50421.5536胸腺指數0.62990.69720.65690.6874表3枯草芽孢桿菌對小白鼠安全性及生產性能指標影響從表1可以看出，在使用枯草芽孢桿菌灌胃小鼠21天后，小鼠均存活。說明實施例2提供的枯草芽孢桿菌沒有毒性。通過檢測小鼠血清中白蛋白alb、總蛋白tp、高密度脂蛋白hdl、低密度脂蛋白總脂ldl、膽固醇cho、堿性磷酸酶alp、白細胞介素6、腫瘤壞死因子等指標，結果顯示均正常。說明實施例2提供的枯草芽孢桿菌沒有毒性。從表2可以看出，小鼠的各臟器指數與第i組對照組比較，沒有較大波動，可以看出枯草芽孢桿菌，沒有造成小鼠各臟器異常。表3綜合表明，實施例2提供的枯草芽孢桿菌對小鼠有增重的作用和效果；且日均采食量與增重情況具有一定的相關性，并且對小鼠的免疫器官等沒有影響。綜合來看，實施例2提供的枯草芽孢桿菌對小鼠是無毒的，不會對小鼠造成毒性結果，是安全的。實驗例2本實驗例提供對實施例2提供的枯草芽孢桿菌的耐酸、耐膽鹽實驗。耐酸實驗配制營養肉湯，用1.0m的鹽酸分別調節ph為2.0、3.0、4.0和5.0，滅菌冷卻后，按營養肉湯總體積2％的量接種待檢枯草芽胞桿菌，設置正常營養肉湯液體培養基(ph＝7.0)接種培養好的枯草芽孢桿菌作為對照組，每個組3個重復。于37℃，150r/min搖床內培養培養24h后測定菌株的od600。表4枯草芽孢桿菌的耐酸實驗結果ph2.0ph3.0ph4.0ph5.0ph7.0od6000.1171a0.2469a0.7105a0.8902a1.1848aod6000.0955a0.2345a0.7372a0.9337a1.0233aod6000.1032a0.2691a0.6876a0.9289a1.2316a從表4可以看出，實施例2提供的枯草芽孢桿菌在酸性培養基中依然能較好的生長，具有較好的耐酸性，能夠在動物尤其是梅花鹿胃液中存活并發揮作用。耐膽鹽實驗配制含0.15％、0.3％、0.6％膽鹽的營養肉湯培養基培養基，滅菌冷卻后，按2％的量接種培養好的枯草芽孢桿菌，于37℃，150r/min，搖床內培養，分別于4h和8h取出相應的培養基，取出各種培養基中培養的菌液1毫升以10倍梯度稀釋，取105稀釋濃度的菌液1毫升加到相應平板上，然后用無菌涂布棒將菌液均勻涂布整個平板，以0h為對照，每組2個重復。活菌計數采用稀釋涂布法，將在各種培養基中培養的菌液以10倍梯度稀釋，取適當稀釋濃度的菌液1毫升加到涂布lb固體培養基，然后用無菌涂布棒將菌液均勻涂布整個平板，于37℃培養24h后計菌落數，再按公式：每毫升原菌液活菌數＝同一稀釋度2個重復平皿菌落平均數×稀釋倍數；計算出每毫升原菌液活菌總數，以培養0h為對照，計算各菌株存活率。表5枯草芽孢桿菌的膽鹽實驗菌落數表6枯草芽孢桿菌不同濃度膽鹽的菌數0.15％膽鹽0.3％膽鹽0.6％膽鹽0h1.20×1071.21×1071.25×1074h1.11×1078.8×1065.0×1068h9.3×1064.8×1062.1×106從表5和表6的結果看，實施例2提供的枯草芽孢桿菌具有較好的耐膽鹽性。實驗例3本實驗例對實施例2提供的枯草芽孢桿菌的碳源利用和化學物質敏感性進行實驗。碳源利用實驗本實驗選用多種常見的碳源對實施例2提供的枯草芽孢桿菌的碳源利用實驗。表7biolog微平板碳源利用生長實驗結果表中，+表示枯草芽孢桿菌可利用，-表示枯草芽孢桿菌不可利用從表7可以看出，實施例2提供的枯草芽孢桿菌碳源可選擇范圍較廣。化學物質敏感性實驗本實驗選取常見的化學物質對實施例2提供的枯草芽孢桿菌進行化學敏感性試驗。表8化學物質敏感性實驗結果(+：不敏感，-：敏感)從表8可以看出，實施例2提供的枯草芽孢桿菌能耐受較多的常見化學物質。實施例4本實驗例對實施例3提供的枯草芽孢桿菌的制備的菌劑或飼料的飼喂效果的檢測。本實驗選用偶蹄動物中的豬形亞目中的豬和反芻亞目中的梅花鹿仔鹿進行飼喂實驗。將實施例3提供的枯草芽孢桿菌的制備的菌劑或飼料按照5×1011cfu/頭的量飼喂梅花鹿仔鹿，連續飼喂3個月。實驗結束后計算梅花鹿仔鹿日均增重量。表9梅花鹿日均增重量及瘤胃液中消化酶的含量從表9可以看出實驗組的平均日增重高于對照組，飼喂含有枯草芽孢桿菌的飼料的梅花鹿瘤胃液中纖維素酶、淀粉酶和胃蛋白酶均高于對照組，脂肪酶低于對照組。在飼喂豬形亞目中的豬的實驗中，其結果與梅花鹿仔鹿實驗結果一致，豬胃液中纖維素酶、淀粉酶和胃蛋白酶均高于對照組，脂肪酶低于對照組。綜上所述，本發明提供一種枯草芽孢桿菌能有效的增加偶蹄目動物胃液中纖維素酶、淀粉酶或胃蛋白酶中至少一種的含量，將上述的枯草芽孢桿菌應用于制備菌劑或者飼料，能較好的改善經濟動物飼養過程中飼料利用低的問題；上述菌劑或者飼料能使偶蹄目動物飼料利用率，達到快速生長的目的，達到直接提高經濟效益的目的，并且具有較好的經濟應用價值和社會推廣應用價值。以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發明的范圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。當前第1頁12