本發明涉及重組腺相關病毒載體的基因治療領域。具體而言，本發明涉及腺相關病毒(aav)衣殼蛋白變體、編碼其的分離的核酸分子、具有所述aav衣殼蛋白變體的重組腺相關病毒載體及其應用于肌病(例如，心肌和/或骨骼肌疾病)治療和預防中的用途。

背景技術：

1、腺相關病毒(aav)是一種單鏈dna病毒，屬于細小病毒家族的依賴病毒屬。通過設計合成重組aav載體(raav)，可以將目的基因運輸并傳遞到靶細胞中。近年來，在基因治療領域的研究中aav載體已占有相當重要的地位(naso?mf,tomkowicz?b,perry?wl?3rd,strohl?wr.adeno-associated?virus(aav)as?a?vector?for?genetherapy.biodrugs.2017；31(4):317-334.)。然而，野生型aav缺乏靶向性，系統給藥時不能有效感染靶組織細胞，導致aav的利用率不能達到最大化，并且非靶向組織細胞存在被感染的風險。因此，提出對aav衣殼進行修飾改造來獲得靶向性高的aav載體，以利于人類疾病的基因治療。

2、目前對aav衣殼蛋白研究較多的突變區域為衣殼(vp)蛋白第588位附近區域。例如，專利申請cn?112011571a中公開了用肽段dgtlavpfk替換aav9衣殼蛋白第587-588位的原有氨基酸aq，得到突變體php.eb，并構建了攜帶有該突變體表達盒的基因表達載體，進一步研究了該載體對神經系統的感染效率以及在治療脊髓性肌萎縮方面的用途。專利cn114127089a中也公開了突變體php.eb；并公開了在將分別編碼aav9-gfp和aav.php.eb-gfp的構建體靜脈注射入到小鼠體內后，發現aav9和aav.php.eb在小鼠腦組織中的轉導效率相當。

3、此外，也提出篩選aav衣殼不同區域的組合突變，以賦予aav載體改善的性能或疊加的優勢。例如，專利cn?113121654a公開了同時對aav外殼的兩個不同區域進行改造，包括用寡肽givadnlqqq替換aav5衣殼蛋白的可變區vr-viii的第574-579位氨基酸，同時引入t711s的點突變，得到突變體aavz82，以降低未攜帶目的基因的空殼載體的形成率，提供載體的實心率。

4、為了拓展raav在基因治療領域的應用潛力，本領域還需要提供新的raav衣殼蛋白突變體，以獲得對靶標組織具有高轉導效率且在非靶標組織中具有低脫靶毒性的重組腺相關病毒載體。

技術實現思路

1、在致力于新的衣殼蛋白變體的開發中，本發明人通過衣殼蛋白變體篩選，獲得了本發明衣殼蛋白變體。與野生型aav9衣殼蛋白相比，本發明的aav衣殼變體，在氨基酸第586位和第589位之間(氨基酸位置根據seq?id?no:9編號)，具有seq?id?no.4的氨基酸序列以替代原始587-588位殘基；且在氨基酸第327位和332位之間(氨基酸位置根據seq?id?no:9編號)，具有seq?id?no.6的氨基酸序列以替代原始328-331位殘基。由所述替代產生的根據本發明的衣殼蛋白變體，在本文中，稱作capx-123/528(其示例之一顯示在seq?id?no:8中)。通過報告基因的表達及熒光強度的對比，在動物實驗中證明衣殼蛋白變體capx-123/528可增強腺相關病毒載體對心肌細胞和各種骨骼肌細胞的轉導，同時降低對肝臟和腎臟的轉導。相比于單獨引入所述588-589位突變或所述328-331位突變，組合兩種突變的aav衣殼蛋白變體，因此不僅擴大了aav重組病毒載體的肌病治療譜，同時帶來了降低的肝/腎毒性，預期可作為aav治療肌病(例如，骨骼肌疾病和心肌疾病)的更優選擇。

2、因此，在第一方面，本發明提供了一種腺相關病毒(aav)衣殼蛋白變體，相對于親本aav衣殼蛋白，所述變體具有如下突變：

3、(a)在氨基酸第586位和第589位之間的氨基酸序列突變，其中所述突變為以seqid?no:4所示的氨基酸序列替代所述親本aav衣殼蛋白的第587-588位殘基，以及

4、(b)在氨基酸第327位和第332位之間的氨基酸序列突變，其中所述突變為以seqid?no:6所示的氨基酸序列替代所述親本aav衣殼蛋白的第328-331位殘基，

5、其中氨基酸位置根據seq?id?no:9編號。

6、在一些實施方案中，與親本aav衣殼蛋白相比，本發明的衣殼蛋白變體賦予包含其的aav病毒粒子對心肌細胞的轉導增加。在一些實施方案中，與親本aav衣殼蛋白相比，本發明的衣殼蛋白變體賦予包含其的aav病毒粒子對骨骼肌細胞的轉導增加。在一些實施方案中，所述骨骼肌細胞選自股四頭肌、肱二頭肌、肱三頭肌、肋間肌和腓腸肌。在另一些實施方案中，與親本aav衣殼蛋白相比，包含本發明的衣殼蛋白變體的aav病毒粒子對心肌細胞和骨骼肌細胞的轉導效率增加，且對肝臟和/或腎臟細胞的轉導效率降低。在一些實施方案，所述心肌細胞的轉導效率增加為增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、350％或400％。在一些實施方案，所述骨骼肌細胞的轉導效率增加為增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、350％或400％。在另一些實施方案中，所述肝臟細胞和/或腎臟細胞的轉導效率降低為降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些實施方案中，對特定細胞群體的轉導效率，可以通過該群體中經由aav轉導而呈陽性細胞的比例來量度。例如，如果將1×106個細胞暴露于aav病毒，并且確定0.5×106個細胞含有至少一個拷貝的aav基因組，則由陽性細胞比例度量的該轉導效率為50％。用于確定該轉導效率的方法包括但不限于流式細胞術。例如，當aav基因組包含編碼綠色熒光蛋白(gfp)的多核苷酸時，可以將gfp+細胞的百分比，作為轉導效率的量度。在另一些實施方案中，對特定細胞群體的轉導效率，也可以通過測量該群體中經由aav轉導而表現出的平均轉基因表達水平來量度，其中所述轉基因包含在aav載體的基因組中并優選地在組成性啟動子控制下表達。例如，當aav基因組包含編碼綠色熒光蛋白(gfp)的多核苷酸時，可以通過測量以該aav轉導的細胞群體的平均gfp表達水平，來量度轉導效率。

7、在一些實施方案中，親本aav衣殼蛋白選自：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12和aav13的aav血清型的衣殼蛋白。在一些實施方案中，親本aav衣殼蛋白具有與aav9衣殼蛋白在結構上相應的表面暴露的高變環vr-ii環和vr-viii環。在一些優選的實施方案中，親本aav衣殼蛋白是aav9衣殼蛋白。

8、在一些更優選的實施方案中，所述親本aav衣殼蛋白是aav9衣殼蛋白，其包含或由如下氨基酸序列組成：

9、(a)seq?id?no:9的氨基酸203至736的氨基酸序列，與其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列；

10、(b)seq?id?no:9的氨基酸137至736的氨基酸序列，與其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列；或

11、(c)seq?id?no:9的氨基酸序列，與其具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

12、在一些實施方案中，本發明的衣殼蛋白變體為vp1、vp2或vp3衣殼蛋白變體，例如，所述衣殼蛋白變體：

13、(a)包含seq?id?no:8的氨基酸序列，或與之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列且在第587位至第588位具有seq?idno:4所示的氨基酸序列以及在第328位至第331位具有seq?id?no:6所示的氨基酸序列；

14、(b)由包含seq?id?no:7或因遺傳密碼的簡并性而與seq?id?no:7的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸編碼；

15、(c)衍生自編碼所述(a)的氨基酸序列或包含所述(b)的核苷酸序列的轉錄物。

16、在一些優選實施方案中，根據本發明的衣殼蛋白變體為包含seq?id?no:8的氨基酸序列或其n端截短序列的vp1,vp2或vp3衣殼蛋白變體。在另一些實施方案中，根據本發明的衣殼蛋白變體為由包含seq?id?no:7的核苷酸序列的核酸編碼的vp1,vp2或vp3衣殼蛋白變體。

17、在第二方面，本發明提供了一種分離的核酸，其中所述核酸包含編碼本發明所述的aav衣殼蛋白變體的多核苷酸序列。

18、在一些實施方案中，根據本發明的核酸包含：

19、(a)編碼seq?id?no:8、或與之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列的多核苷酸；或

20、(b)seq?id?no:7的核苷酸序列，或與其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的核苷酸序列。

21、在一些實施方案中，根據本發明的核酸能夠轉錄并表達選自以下的至少一種或任意兩種或全部三種aav衣殼蛋白：vp1,vp2和vp3。在本文中，就核酸而言的表述“能夠轉錄并表達”，是指當將所述核酸置于合適的啟動子控制下，可以在引入所述核酸的適宜細胞中轉錄并表達產生所述及的基因產物。

22、在第三方面，本發明提供了一種核酸載體，例如，核酸表達載體，其包含本發明所述的核酸。在一些實施方案中，所述載體還包含編碼aav?rep蛋白的核酸。在一些實施方案中，所述載體是質粒。

23、在第四方面，本發明提供了一種分離的宿主細胞，其包含本發明所述的核酸，任選地所述核酸穩定轉染所述宿主細胞，優選地，所述宿主細胞還包含編碼aav?rep蛋白的核酸和/或編碼輔組病毒功能的核酸。

24、在一些實施方案中，所述宿主細胞是重組腺相關病毒載體(raav)生產細胞。在一些實施方案中，所述核酸穩定轉染所述生產細胞。在另一些實施方案中，所述生產細胞還包含編碼aav?rep蛋白(尤其是aav9或aav2的rep蛋白)的核酸。在另一些實施方案中，所述生產細胞還包含能夠反式提供aav復制和組裝所需的輔助病毒功能(例如，來自腺病毒的e1a和e1b輔助基因、和/或e4、e2a和va輔助基因)的核酸。在另一些實施方案中，所述生產細胞還包含攜帶異源核酸的raav基因組。

25、在第五方面，本發明提供了，將編碼根據本發明的aav衣殼蛋白變體的根據本發明的核酸、根據本發明的載體或根據本發明的宿主細胞或生產細胞用于制備重組腺相關病毒(raav)載體的用途和方法。在一些實施方案中，所述用途或方法包括：

26、(i)提供根據本發明的生產細胞；

27、(ii)在允許包裝產生包含重組aav基因組的raav病毒粒子的條件下培養所述細胞；和

28、(iii)收獲培養的宿主細胞或培養基，以收集產生的重組aav病毒載體。

29、在第六方面，本發明提供了一種重組腺相關病毒(raav)載體，其包含根據本發明的衣殼蛋白變體或使用包含根據本發明的核酸的本發明生產細胞產生。優選地，根據本發明的raav載體具有主要由或由本發明的衣殼蛋白變體組成的衣殼。

30、在一些實施方案中，相對于包含野生型aav衣殼蛋白的raav載體或相對于包含親本衣殼蛋白的參考raav載體，包含根據本發明的衣殼蛋白變體的raav載體表現出對肌細胞(尤其是心肌細胞和骨骼肌細胞)的轉導增加，且任選地對肝臟細胞和/或腎臟細胞的轉導降低。

31、在一些實施方案中.根據本發明的raav載體在其基因組中包含：

32、a.5’和3’aav反向末端重復(itr)序列，和

33、b.位于5’和3’itr之間包含異源核酸的表達構建體，其中所述異源核酸編碼目的基因產物；

34、優選地，其中所述表達構建體包含以轉錄方向彼此功能性連接的如下元件：

35、-啟動子，

36、-異源核酸，

37、-轉錄終止子。

38、在一些實施方案中，所述異源核酸編碼用于基因置換、基因阻抑或基因編輯的目的基因產物，優選地，所述目的基因產物為蛋白質或rna。

39、在第七方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含根據本發明的重組aav病毒載體和可藥用載體。

40、在第八方面，本發明提供了一種向有需要的受試者遞送異源核酸的方法，其中所述方法包括向受試者施用根據本發明的重組aav病毒載體或根據本發明的藥物組合物，例如，通過肌內注射或靜脈內注射施用，例如，用于治療或預防肌病，例如遺傳性肌病。在一些實施方案中，所述肌病選自心力衰竭和遺傳性心肌病。在另一些實施方案中，所述肌病為骨骼肌疾病。

41、在第九方面，本發明提供了根據本發明的重組aav病毒載體的用途，用于制備治療或預防肌病，例如遺傳性肌病的藥物組合物，優選地，通過肌內注射或靜脈注射施用所述藥物組合物。