本發明屬于毒理學評價領域，具體涉及一種評價供試品溶血性的方法。

背景技術：

1、溶血(hemolysis)是指紅細胞(red?blood?cells,?rbc)破裂或破壞，導致血紅蛋白和其他細胞內容物釋放到周圍環境中，它可以在各種情況下發生。因為溶血可能會導致貧血、黃疸等病理情況，對人體健康造成威脅，為了確?？赡苤苯优c血液接觸的藥物和醫療器械等的安全性，在研發過程中進行溶血試驗是非常重要的。凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應的其他藥物制劑均應進行溶血性試驗。

2、傳統的溶血試驗方法用兔血或人血，單次取血量少，試驗用血量大時需要不同的供體樣本混合，不利于結果穩定性。需要額外購買、獲得動物或者需要復雜的倫理審批過程。此外，傳統的溶血試驗方法通過肉眼觀察法或檢測血紅蛋白（hb）的方法進行評價。其中，肉眼觀察法易受到試驗人員的主觀影響，特別是對于有顏色的供試品或溶血現象不明顯時，結果與真實值可能有較大出入，并且通過肉眼觀察法無法進行定量評價。進一步提高溶血試驗的靈敏性、重復性和穩定性，豐富溶血試驗的檢測標志物種類以應對更多的使用場景和供試品類型，對于確保藥物和醫療器械的安全尤為重要。

技術實現思路

1、為解決現有技術中評價溶血性的方法的靈敏性、重復性和穩定性有待進一步提高，并需要豐富評價溶血性的檢測標志物種類的技術問題，本發明提供一種評價供試品溶血性的方法。本發明提供的方法中采用猴血，基于在非臨床動物試驗過程中終末期動物解剖時可以收集到大量全血的特點，不同組別供試品可以通過同一樣本進行評價，提高數據穩定性。另外，與試驗兔相比，食蟹猴與人紅細胞跟更接近，更接近臨床應用結果。此外，本發明提供的方法與傳統的血紅蛋白法相比具有更好的穩定性、更高的靈敏性和穩定性。

2、為解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案：

3、本發明第一方面提供一種評價供試品溶血性的方法，所述方法包括以下步驟：

4、（1）將血液樣本進行離心或靜置，從血球層取樣并溶解紅細胞，檢測糖化血紅蛋白的濃度作為試前濃度；

5、（2）供試品與血液樣本相接觸；

6、（3）對步驟（2）所得血液樣本進行離心或靜置后，從血漿層取樣并檢測糖化血紅蛋白的濃度作為試后濃度；

7、（4）比較所述試前濃度和所述試后濃度，進行溶血性結果判定。

8、本發明一些具體實施方案中，步驟（4）中進行溶血性結果判定時，溶血性（溶血率）=hba1c%試前/hba1c%試后=?{?[(hba1c試前/hb試后)×a+b]/?[(hba1c試前/hb試后)×a+b]?}×100。（a和b是由糖化血紅蛋白檢測試劑盒中的試劑校準品得到的常數，本批次檢測中a和b分別為91.5和2.15）。

9、本發明中，糖化血紅蛋白的檢測原理為在蛋白酶的作用下，糖化血紅蛋白的β鏈n末端被切斷并釋放糖化二肽。第一反應通過測定480?nm的吸光度，可求出hb濃度。第二反應中果糖基肽氧化酶(fpox)作用于糖化二肽，生成過氧化氫；在過氧化物酶的存在下，過氧化氫與顯色劑產生顯色反應，通過測定660?nm的吸光度可求出hba1c的濃度。根據求得的hba1c濃度與hb濃度計算出hba1c%?(ngsp)。hba1c和hb濃度的檢測方法、以校準品配制校準樣品進行校準、hba1c%的計算可根據試劑盒說明書或以本領域常規技術手段進行選擇和調整。

10、本發明一些實施方案中，所述供試品為藥物、細胞、納米粒子或醫療器械。

11、本發明一些較佳的實施方案中，所述細胞為干細胞。

12、本發明一些較佳的實施方案中，所述納米粒子為脂質體；

13、本發明一些較佳的實施方案中，所述醫療器械為血管內導管、機械心臟瓣膜、生物心臟瓣膜、人工血管或支架；

14、本發明一些實施方案中，所述血液樣本為兔血、猴血或人血。

15、本發明一些具體實施方案中，所述血液樣本為猴血。

16、本發明一些實施方案中，所述方法為體外檢測方法。

17、本發明一些實施方案中，所述方法為非診斷或治療目的的。

18、本發明一些實施方案中，步驟（2）中供試品與血液樣本在37℃±0.5℃接觸。

19、本發明一些較佳的實施方案中，步驟（2）中供試品與血液樣本在37℃接觸。

20、本發明一些實施方案中，步驟（2）中供試品與血液樣本的接觸時間為1-12h。

21、本發明一些較佳的實施方案中，步驟（2）中供試品與血液樣本的接觸時間為1-3h。

22、本發明一些實施方案中，步驟（1）和步驟（3）中所述糖化血紅蛋白的濃度為糖化血紅蛋白的絕對濃度占總血紅蛋白絕對濃度的百分比。

23、本發明一些實施方案中，步驟（4）中以糖化血紅蛋白的所述試前濃度與所述試后濃度的比值作為結果判定的參數；所述參數與cut?off值相比較，當所述試前濃度與所述試后濃度的比值大于cut?off值時，所述供試品導致溶血的風險高；當所述試前濃度與所述試后濃度的比值小于或等于cut?off值時，所述供試品導致溶血的風險低。

24、本發明一些可選的實施方案中，步驟（1）中以溶血劑溶解紅細胞，步驟（3）中包含向所述血漿層加入溶血劑的過程。

25、本發明一些可選的實施方案中，所述血球層的取樣與加入的所述溶血劑的體積比例為1:?(20-100)；和/或，所述血漿層的取樣與加入的所述溶血劑的體積比為1:?(20-100)。

26、本發明一些可選地具體實施方案中，所述血球層的取樣與加入的所述溶血劑的體積比例為1:20；和/或，所述血漿層的取樣與加入的所述溶血劑的體積比為1:20

27、本發明一些實施方案中，步驟（4）中所述cut?off值為空白樣本的所述試前濃度與所述試后濃度的比值的平均值+3個標準差。

28、本發明一些較佳的實施方案中，所述空白樣本的數量為5-1000個，例如為5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個。

29、本發明第二方面提供一種檢測生物標志物的試劑在評價供試品溶血性中的應用，所述生物標志物為糖化血紅蛋白。

30、本發明一些實施方案中，所述檢測為體外檢測。

31、本發明一些實施方案中，所述檢測為非診斷或治療目的的。

32、本發明一些實施方案中，所述試劑包含以下一種或多種：蛋白水解酶、過氧化物酶、果糖氨基酸氧化酶和顯色基質。

33、本發明一些實施方案中，以糖化血紅蛋白的所述試前濃度與所述試后濃度的比值作為結果判定的參數；所述參數與cut?off值相比較，當所述試前濃度與所述試后濃度的比值大于cut?off值時，所述供試品導致溶血的風險高；當所述試前濃度與所述試后濃度的比值小于或等于cut?off值時，所述供試品導致溶血的風險低。

34、本發明一些較佳的實施方案中，所述cut?off值為空白樣本的所述試前濃度與所述試后濃度的比值的平均值+3個標準差。

35、本發明一些實施方案中，所述空白樣本的數量為5-1000個，例如為5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個。

36、本發明一些實施方案中，所述供試品為藥物、細胞、納米粒子或醫療器械。

37、本發明一些較佳的實施方案中，所述細胞為干細胞，所述納米粒子為脂質體，所述醫療器械為血管內導管、機械心臟瓣膜、生物心臟瓣膜、人工血管或支架。

38、本發明第三方面提供一種試劑盒在制備檢測溶血程度的產品中的應用，所述試劑盒包含糖化血紅蛋白和/或檢測糖化血紅蛋白的試劑。

39、本發明中，“溶血程度”指的是紅細胞發生溶解現象的程度，可以“溶血率”進行表征?！叭苎浴敝傅氖撬幬锏幕钚猿煞旨捌浯x物、輔料及理化性質或醫療器械的理化性質可能導致受試者發生溶血即紅細胞溶解的特性。

40、本發明一些實施方案中，所述試劑包含以下一種或多種：蛋白水解酶、過氧化物酶、果糖氨基酸氧化酶和顯色基質。

41、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。

42、本發明所用試劑和原料均市售可得。

43、本發明的積極進步效果在于：本發明提供的評價供試品溶血性的方法相較于現有技術中以總血紅蛋白作為評價指標的方法具有敏感性、重復性和穩定性更高的優勢，能夠豐富溶血試驗的檢測標志物種類，在用于確保藥物和醫療器械的安全中具有廣闊的應用前景。