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利用SsDMS突變體高效生產(chǎn)新穎drimane型倍半萜化合物

文檔序號(hào):41758811發(fā)布日期:2025-04-29 18:27閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種ssdms酶突變體,其特征在于,將氨基酸序列如seq?id?no:1所示的ssdms酶其中第208位氨基酸由天冬酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸,第248位氨基酸由苯丙氨酸變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或組氨酸,第249位氨基酸由異亮氨酸變成丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或組氨酸,第497位氨基酸由谷氨酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酸,第505位氨基酸由酪氨酸變成丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或組氨酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ssdms酶突變體,其特征在于,所述ssdms酶是來(lái)源于細(xì)菌streptomyces?showdoensis的ii型萜類(lèi)環(huán)化酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ssdms酶突變體,其特征在于,所述ssdms酶突變體是通過(guò)定點(diǎn)突變方法得到的。

4.一種ii型萜類(lèi)環(huán)化酶ssdms酶的定向進(jìn)化方法,其特征在于,通過(guò)ssdms酶與底物復(fù)合物的蛋白質(zhì)共晶結(jié)構(gòu)搜索活性空腔底物附近范圍內(nèi)的氨基酸進(jìn)行丙氨酸掃描,對(duì)有新穎活性的突變位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。

5.權(quán)利要求1所述的ssdms酶突變體在生物合成萜類(lèi)化合物中的應(yīng)用。

6.一種改造ii型萜類(lèi)環(huán)化酶ssdms定點(diǎn)突變位點(diǎn)的高效融合表達(dá)載體,其特征在于,它是將水解酶及權(quán)利要求1所述ssdms酶突變體融合的表達(dá)載體;其中,水解酶及權(quán)利要求1所述ssdms酶突變體融合的氨基酸序列是將如seq?id?no:3所示的氨基酸序列中第397位由天冬酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸,第437位由苯丙氨酸變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或組氨酸、第438位由異亮氨酸變成丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或組氨酸,第686位由谷氨酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酸,第694位由酪氨酸變成丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或組氨酸。

7.一種新穎drimane型倍半萜化合物高效生產(chǎn)的大腸桿菌,其特征在于,同時(shí)導(dǎo)入權(quán)利要求6所述高效融合表達(dá)載體以及含氨基酸序列為seq?id?no:5-7和seq?id?no:9的表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞。

8.權(quán)利要求7所述的新穎drimane型倍半萜化合物高效生產(chǎn)的大腸桿菌在生產(chǎn)drimane型倍半萜化合物中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于,所述drimane型倍半萜化合物包括drimenol、albicanol、bicyclofarnesol、drimane-8α,11-diol中的一種或多種化合物。

10.一種權(quán)利要求7所述的大腸桿菌生產(chǎn)drimane型倍半萜化合物的方法,其特征在于,發(fā)酵培養(yǎng)基為含1-5%的甘油,菌液培養(yǎng)至od600=1.3~1.4時(shí)誘導(dǎo),誘導(dǎo)時(shí)加入異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷以及3-甲基-2-丁烯-1醇、3-甲基-3-丁烯-1醇。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于丙氨酸掃描的來(lái)源于Streptomyces?showdoensis的II型倍半萜環(huán)化酶SsDMS的定向進(jìn)化策略及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的若干個(gè)能夠催化生成新穎drimane型倍半萜化合物的SsDMS關(guān)鍵突變體位點(diǎn),包括208、248、249、497、505位的取代。本發(fā)明公開(kāi)了應(yīng)用于SsDMS突變體異源表達(dá)和新穎drimane型倍半萜化合物高效生產(chǎn)的高效大腸桿菌細(xì)胞工廠(chǎng),進(jìn)一步獲得了結(jié)構(gòu)新穎的drimane型倍半萜化合物。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了利用SsDMS及其突變體高效生產(chǎn)drimane型倍半萜化合物,其改造策略具有廣泛的適用性,為生物合成新穎萜類(lèi)化合物提供了重要的酶學(xué)資源,為藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了更多選擇。

技術(shù)研發(fā)人員:董廖斌,董淑敏,潘興明
受保護(hù)的技術(shù)使用者:中國(guó)藥科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/4/28
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