本發明屬于生物工程，具體涉及木薯memyb基因、受ga誘導myb轉錄因子功能驗證的方法。

背景技術：

1、木薯(manihot?esculenta?crantz)是世界三大薯類作物之一，起源于熱帶美洲，因其適應性強，耐旱、耐貧瘠等優勢而被廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區，是熱帶濕地低收入農戶的主要食糧。自2008年國家木薯產業技術體系成立以來，越來越多的科研工作者致力于木薯研究。木薯全產業鏈的研究包含木薯種質資源、木薯遺傳育種、木薯栽培、木薯采后加工等方面。而關鍵基因的發掘對木薯育種乃至全產業鏈的研究有重要意義。myb轉錄因子是植物代謝網絡中最重要的轉錄調控因子之一，控制植物的生長發育、信號轉導、次生代謝以及在生物和非生物脅迫中也產生重要作用。gamyb是一個受赤霉素ga調控的編碼一個r2r3-myb?dna結合結構域的myb類轉錄因子，在植物生長發育過程中起著重要作用，是ga信號應答途徑中首個被鑒定出來的正向作用的因子。ga是一類重要的植物激素，其在植物開花誘導、果實發育以及次生代謝產物的合成等過程起著重要作用。本研究提供一種受ga調控的myb轉錄因子，對木薯次生代謝物如花青素、類胡蘿卜素等的合成調控有著重要作用。

2、基因功能驗證一般采用本底遺傳轉化的方式，但是存在周期長的缺陷，甚至有一些植物自身遺傳轉化體系尚未成熟。

技術實現思路

1、針對現有技術存在的不足，本發明提供一種受ga誘導myb轉錄因子功能驗證的方法，通過在真核酵母種驗證基因功能，具有快速、可靠的優點，為進一步深入研究基因的功能奠定基礎。

2、為實現上述目的，采用以下技術方案：提供一種受ga誘導myb轉錄因子功能驗證的方法，包括以下步驟：

3、步驟s1.megamyb基因的克隆；通過pcr方法擴增獲得含有堿基序列1533bp片段的木薯megamyb基因；

4、步驟s2.megamyb基因的亞細胞定位；

5、步驟s3.megamyb基因的酵母自激活驗證；

6、步驟s4.megamyb基因的ga誘導功能驗證；

7、其中，步驟s4具體方法包括：

8、s4-1.采用同源重組方法，將megamyb基因構建到酵母表達載體pdr196中，構建好的重組載體分別命名為pdr196-megamyb，將重組質粒轉化至酵母菌株w303；

9、s4-2.pdr196-megamyb酵母表達載體ga3誘導表達。

10、優選地，步驟s1中，采用pcr的方法，sc9木薯葉片cdna為模板，設計特異引物擴增megamyb基因，全長擴增引物的正向引物megamyb-f為atgagcaaaatgacaaatgg，反向引物megamyb-r為ctagcattcgctatcaatat。

11、優選地，步驟s2中，megamyb基因的亞細胞定位引物的正向引物megamyb-gfp-f為

12、agtggtctctgtccagtcctatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-gfp-r為

13、ggtctcagcagaccacaagtctagcattcgctatcaatat。

14、優選地，步驟s3中，megamyb基因的酵母自激活引物的正向引物megamyb-bd-f為

15、atggaggccgaattcatgagcaaaatgacaaat，

16、反向引物megamyb-bd-r為

17、cgacggatccccgggctagcattcgctatcaatat。

18、優選地，步驟s4-1具體方法包括：

19、s4-1-1.制備w303感受態細胞

20、保存的w303菌種在固體培養基ypda上劃線，30℃培養3天，挑取單菌落接種至ypda液體培養基中，od600達到0.4～0.5后，3000g離心5分鐘，棄去上清，用10ml溶液a重懸菌體，3000g離心5分鐘，棄去上清；在沉淀中加入1ml1*te/liac進行重懸，即獲得酵母感受態細胞，按50μl分裝于無菌凍存管備用；

21、s4-1-2.轉化w303

22、配置預混液，取360μl預混液加入感受態細胞w303中，高速混勻，使酵母細胞完全懸浮于液體中；置于30℃水浴熱激45～60分鐘，每10-15分鐘混勻一次，結束后3000g離心3分鐘，棄上清，用0.9％nacl重懸后涂于sd+葡萄糖固體板上，30℃倒置培養2～3天。

23、優選地，步驟s4-2具體方法為：挑選陽性克隆加入到sd/-ura液體培養基中，30℃，220rpm搖動培養過夜，調整至od600至1.0，依次稀釋10倍，100倍，1000倍，分別取5μl點在sd/-ura+10mm?ga3平板上，待吸收完全后30℃培養箱中培養3天；以正常培養作為對照，比較轉pdr196-megamyb和pdr196空載體質粒的酵母菌株的生長情況；說明megamyb在能在ga3條件下生長比對照好。

24、優選地，megamyb基因的酵母功能驗證引物的正向引物megamyb-pdr196-f為

25、atataccccagcctcgatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-pdr196-r為

26、cgataagcttgatatcctagcattcgctatcaat。

27、本發明另一目的在于提供一種木薯megamyb基因，采用pcr方法擴增得到其核苷酸序列如seq?id?no：1所示的木薯megamyb基因。

28、本發明具有以下的有益效果：

29、1.本發明通過pcr方法，設計全長擴增引物擴增獲得含有堿基序列1533bp片段的木薯megamyb基因。

30、2.本發明通過設計megamyb的亞細胞定位引物，megamyb定位在細胞核中。

31、3.本發明通過設計megamyb的自激活引物，采用酵母自激活驗證方法，顯示與pgbkt7(bd)-megamyb對pgadt7(ad)無激活功能，與空ad/bd一致，不存在互作關系，即megamyb無自激活活性。

32、4.本發明通過設計megamyb的酵母功能驗證引物，采用ga誘導功能驗證方法，以正常培養作為對照，比較轉pdr196-megamyb和pdr196空載體質粒的酵母菌株的生長情況。結果顯示pdr196-megamyb在ga3條件下生長比對照好，megamyb能受ga誘導。

技術特征：

1.一種受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述的受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于：步驟s1中，設計特異引物擴增megamyb基因，全長擴增引物的正向引物megamyb-f為atgagcaaaatgacaaatgg，反向引物megamyb-r為ctagcattcgctatcaatat。

3.根據權利要求1所述的受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于：步驟s2中，megamyb基因的亞細胞定位引物的正向引物megamyb-gfp-f為agtggtctctgtccagtcctatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-gfp-r為ggtctcagcagaccacaagtctagcattcgctatcaatat。

4.根據權利要求1所述的受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于：步驟s3中，megamyb基因的酵母自激活引物的正向引物megamyb-bd-f為atggaggccgaattcatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-bd-r為cgacggatccccgggctagcattcgctatcaatat。

5.根據權利要求1所述的受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于，步驟s4-1具體方法包括：

6.根據權利要求1所述的受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于，步驟s4-2具體方法為：挑選陽性克隆加入到sd/-ura液體培養基中，30℃，220rpm搖動培養過夜，調整至od600至1.0，依次稀釋10倍，100倍，1000倍，分別取5μl點在sd/-ura+10mm?ga3平板上，待吸收完全后30℃培養箱中培養3天；以正常培養作為對照，比較轉pdr196-megamyb和pdr196空載體質粒的酵母菌株的生長情況；說明megamyb在能在ga3條件下生長比對照好。

7.根據權利要求6所述的受ga誘導的木薯myb轉錄因子功能驗證方法，其特征在于：megamyb基因的酵母功能驗證引物的正向引物megamyb-pdr196-f為atataccccagcctcgatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-pdr196-r為cgataagcttgatatcctagcattcgctatcaat。

8.一種木薯megamyb基因，其特征在于：采用權利要求1的pcr方法擴增得到其核苷酸序列如seq?id?no：1所示的木薯megamyb基因。

技術總結
本發明屬于生物工程技術領域，公開了一種受GA誘導的木薯MYB轉錄因子功能驗證方法，包括以下步驟：步驟S1.MeGAMYB基因的克隆；通過PCR方法擴增獲得含有堿基序列1533bp片段的木薯MeGAMYB基因；步驟S2.MeGAMYB基因的亞細胞定位；步驟S3.MeGAMYB基因的酵母自激活驗證；步驟S4.MeGAMYB基因的GA誘導功能驗證；通過在真核酵母種驗證基因功能，具有快速、可靠的優點，為進一步深入研究基因的功能奠定基礎。

技術研發人員：羅秀芹,韋卓文,薛晶晶,蔡杰,安飛飛,陳松筆,張貝,羅秀平
受保護的技術使用者：中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24