本發(fā)明微生物抑菌領域，具體涉及一株廣譜抑菌的銅綠假單胞菌jcl-3及其應用。

背景技術：

1、水產養(yǎng)殖作為全球重要的食品生產行業(yè)，為人類提供了豐富的蛋白質來源，在保障糧食安全與促進經(jīng)濟發(fā)展方面扮演關鍵角色。近年來，隨著人們對水產品需求的持續(xù)增長，水產養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，集約化、高密度養(yǎng)殖模式成為主流。然而，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化與養(yǎng)殖密度的增加，導致各類病害頻發(fā)。各種水產病害菌，像維氏氣單胞菌會引起魚類腸炎、潰瘍和出血等疾病；霍亂弧菌可以通過水體或飼料傳播。感染的魚類呈現(xiàn)寡活性、食欲減退、口吻紅腫、腹瀉等癥狀。嚴重感染可能導致魚類死亡。

2、長期以來，抗生素在水產養(yǎng)殖病害防治中被廣泛應用。但頻繁使用抗生素不僅會使這些有害菌類產生耐藥性，還會在養(yǎng)殖水體和水產品中造成藥物殘留。這不僅威脅人類健康，還破壞水域生態(tài)環(huán)境平衡。傳統(tǒng)的滅活疫苗雖具有一定的免疫效果，但存在免疫應答較弱、持續(xù)時間短等問題。滅活疫苗主要激發(fā)機體的體液免疫，對細胞免疫的激活作用有限，難以提供全面持久的免疫保護。此外，制備滅活疫苗過程復雜，成本較高，限制了其大規(guī)模應用。滅活疫苗生產需要嚴格的滅活條件控制，且需大量的抗原制備，增加了生產成本與時間成本。

3、弱毒疫苗作為一種新型疫苗，具有獨特優(yōu)勢。它通過對病原菌進行減毒處理，使其在保留免疫原性的同時，致病力顯著降低。接種后，弱毒菌株可在宿主體內有限繁殖，模擬自然感染過程，能有效激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫應答，產生更持久、更全面的免疫保護。相較于滅活疫苗，弱毒疫苗只需較少的接種劑量和次數(shù)，即可誘導較強的免疫反應，且生產成本相對較低。

4、銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)屬于變形菌門，是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長棒形的細菌，只有單向的運動性在普通瓊脂平板上形成光滑，濕潤，微隆起，邊緣整齊波狀的中等大菌落，具有一定的透明度，常呈融合狀態(tài)。數(shù)日后，培養(yǎng)基的綠色逐漸變深，菌落表面呈現(xiàn)金屬光澤。菌體的一端有單鞭毛，在暗視野顯微鏡或相差顯微鏡下觀察可見細菌運動活潑，無芽胞，能形成莢膜。易被普通染料著染。最適生長溫度為25～30℃。

5、銅綠假單胞菌營養(yǎng)需求簡單、生長速度快，這使得其生產發(fā)酵的成本較低，有利于開發(fā)成弱毒疫苗。銅綠假單胞菌的生態(tài)適應性良好，可以和多種微生物競爭，有助于控制病原菌，其效果持久、爭對性強，展現(xiàn)出良好的應用前景。

6、研發(fā)針對銅綠假單胞菌的水產弱毒疫苗，對水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。一方面，可有效減少抗生素的使用，降低藥物殘留和環(huán)境污染風險，保障水產品質量安全。另一方面，為水產動物提供高效的免疫保護，降低病害發(fā)生率和死亡率，提高養(yǎng)殖產量和經(jīng)濟效益，促進水產養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展。眾多研究和實踐均表明，合理使用弱毒疫苗可顯著提升水產養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益與生態(tài)效益。

7、alternaria?alternata是一種真菌，會引起葉斑、腐爛、枯萎病和其他植物病害。菌落的質地通常是天鵝絨般的或羊毛狀的。菌落絮狀，生長迅速，初期暗白色，老后變暗；背面褐色。它是一種機會性病原體，影響超過380種植物。它是干旱、溫暖氣候中最普遍的霉菌。f.commune是一種有廣泛地理分布和寄主范圍的植物根腐病病原菌?？梢鸢姿?、道格拉斯冷杉、康乃馨、玉米、胡蘿卜、大麥等作物根腐病。f.commune與f.oxsproum形態(tài)特征極為相似。菌落白色，氣生菌絲絨狀，可產生分生孢子。f.oxsproum是一類既可侵染植物又可在土壤內生存的兼性寄生真菌，屬于半知菌類、從梗孢目、瘤座孢科、鐮刀菌屬。菌落突起絮狀,菌絲白色質密。菌落粉白色,淺粉色至肉色?？梢鸸项?、茄科、香蕉、棉、豆科等多種植物發(fā)生枯萎病。以上三種植物性病原真菌對植物危害巨大，而普通常用的化學手段會造成抗藥性，農藥殘留等弊端。生物防治則更加綠色，環(huán)保。銅綠假單胞菌對植物性病原真菌有抑制作用，例如銅綠假單胞菌cwd-d做成生防菌劑用于防治芋疫霉菌、荔枝霜疫霉菌和辣椒疫霉菌等由這些病菌引起的植物病害。還有銅綠假單胞菌kk9a對大麗輪枝菌具有高效拮抗作用，能用于大麗輪枝菌引起的作物黃萎病的防治，對棉花黃萎病有顯著防治效果。但是目前可以同時抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、alternaria?alternata、f.commune、f.oxsproum的銅綠假單胞菌目前還沒有研究報道。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一株廣譜抑菌的銅綠假單胞菌jcl-3，該菌株具有廣譜抑菌性，能夠拮抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、植物性病原真菌和水產病害菌的生長，如對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、alternaria?alternata、f.commune、f.oxsproum、霍亂弧菌、維氏氣單胞菌均具有優(yōu)異的抑菌效果，可以防治水產病害菌和植物性病原真菌。

2、本發(fā)明還提供所述廣譜抑菌的銅綠假單胞菌jcl-3的應用。

3、技術方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的一株廣譜抑菌的銅綠假單胞菌(pseudomonas?aeruginosa)jcl-3，已保藏于中國典型微生物保藏中心，保藏編號為cctccno：m?2024211，保藏時間為2024年01月25日。

4、本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌jcl-3的篩選方法，包括如下步驟：

5、從病死加州鱸魚腸道中取出組織樣本，放入無菌生理鹽水中，充分振蕩，制成菌懸液。用稀釋涂布平板法將菌懸液涂布在lb固體培養(yǎng)基上，倒置過夜培養(yǎng)得到初篩菌株，以分離篩選得到的初篩菌株為供試菌，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，采用牛津杯法篩選出對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌拮抗效果的銅綠假單胞菌jcl-3。

6、本發(fā)明所述銅綠假單胞菌jcl-3在抑制或者拮抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、植物性病原真菌以及水產病害菌中的應用。

7、其中，所述銅綠假單胞菌jcl-3在抑制或者拮抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、alternaria?alternata、f.commune、f.oxsproum、霍亂弧菌、維氏氣單胞菌中的應用。

8、本發(fā)明所述的含有銅綠假單胞菌jcl-3的發(fā)酵產物或者菌劑。

9、本發(fā)明所述銅綠假單胞菌jcl-3的發(fā)酵產物或者菌劑在抑制或者拮抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、植物性病原真菌以及水產病害菌中的應用。

10、其中，所述發(fā)酵產物由銅綠假單胞菌jcl-3接種于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，獲得發(fā)酵產物。

11、其中，所述培養(yǎng)基為：胰蛋白胨5-10g/l，酵母提取物5-10g/l，氯化鈉10-15g/l，ph6.8-7.0。

12、進一步地，所述培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，ph6.8-7.0。

13、其中，所述發(fā)酵條件為在種子液到達對數(shù)期時，按照體積比1-2％接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，開始發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制溫度維持在32-37℃，搖床轉速150-180r/min，發(fā)酵48-60小時。

14、作為優(yōu)選，按照2％接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，開始發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制溫度維持在37℃，搖床轉速180r/min，發(fā)酵48小時。

15、其中，所述發(fā)酵產物或者菌劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、alternariaalternata、f.commune、f.oxsproum、霍亂弧菌、維氏氣單胞菌抑制或者拮抗中的應用。

16、本發(fā)明所述銅綠假單胞菌jcl-3在制備水產弱毒疫苗和防治植物性病原真菌的生防制劑或者抗菌劑中的應用。

17、有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

18、本發(fā)明經(jīng)分離篩選獲得廣譜抑菌菌株jcl-3，本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌jcl-3對多種水產病害菌展現(xiàn)出顯著的抑制活性。基于此特性，該菌株具備制備成水產弱毒疫苗的潛力。這對水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義，其可以降低藥物在養(yǎng)殖環(huán)境及水產品中的殘留風險，有力保障水產品的質量安全，減少對周邊生態(tài)環(huán)境的污染。另外，為水產動物提供高效的免疫保護，降低病害發(fā)生率和死亡率，提高養(yǎng)殖產量和經(jīng)濟效益，促進水產養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展。

19、此外，本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌jcl-3，該菌株對植物病原真菌的菌絲生長有明顯的抑制效果，可制成防治植物性病原真菌的生防制劑，減少植物病害，或用于真菌引發(fā)的疾病，改善健康狀態(tài)，更加綠色環(huán)保，同時該菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌也具有很好的抑菌效果。有效解決了各種致病菌對環(huán)境、農作物和人體健康的危害問題。

20、本發(fā)明菌株jcl-3對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、alternaria?alternata、f.commune、f.oxsproum、霍亂弧菌、維氏氣單胞菌均具有優(yōu)異的抑菌效果，可以防治水產病害菌和植物性病原真菌，具有非常廣譜的抑菌性能。