本發明屬于分子檢測，具體地說，是關于一種檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的引物和探針組合及其應用。

背景技術：

1、細菌耐藥已成為全球公共健康領域的重大挑戰，其中尤以碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌，也稱為碳青霉烯類耐藥細菌(cro)引起的感染形式最為嚴峻。cro主要包括碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌(cre)、碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌(crpa)和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(crab)，是臨床醫院感染重點監測的病原菌之一。碳青霉烯類抗生素是抗菌譜廣、抗菌活性最強的一類β-內酰胺酶抗生素，因其具有對β-內酰胺酶穩定以及毒性低等特點，已成為治療cro最主要的抗菌藥物之一。然而隨著碳青霉烯類抗生素的大范圍使用，耐藥株不斷出現，容易引起復發性感染，致使治療失敗和增加病死率。耐藥菌株耐藥主要原因是產生了碳青霉烯酶，開展碳青霉烯酶的檢測勢在必行。

2、目前實驗室檢測碳青霉烯酶的方法分為表型檢測和基因型檢測兩種。表型檢測方法包括carba?np試驗、改良碳青霉烯滅活試驗、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗，其中，carbanp試驗采用自制試劑，部分試劑有效期短；改良碳青霉烯滅活試驗和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗均需進行過夜培養。基因型檢測方法包括酶免疫層析技術和基因檢測技術，酶免疫層析技術價格較高。基因型檢測有實時熒光定量pcr、全基因組測序(wgs)等。實時熒光定量pcr靈敏度、特異性高但依賴精密儀器，檢測成本較高。全基因組測序(wgs)可全面解析耐藥基因譜，但數據分析復雜耗時長，且專業性要求很高。

3、因此，開發一款快速、靈敏、特異、操作簡便、成本低的碳青霉烯耐藥基因及常見cro檢測試劑盒，對指導臨床醫生選擇合適的藥物，避免加重細菌的耐藥和耽誤臨床診治具有重要意義。

技術實現思路

1、本發明的目的在于彌補現有技術的不足，提供一種檢測檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cre的引物和探針組合，具有檢測指標多、成本低、特異性高、靈敏度高，反應時間短、易于操作等優點。

2、為了實現上述目的，本發明的第一個方面，提供了一種用于檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的引物和探針組合，所述引物和探針組合為lamp擴增所需，包括：

3、(1)seq?id?no.1～2所示的外引物、seq?id?no.3～4所示的內引物、seq?id?no.5～6所示的環引物和seq?id?no.7所示的探針；

4、(2)seq?id?no.8～9所示的外引物、seq?id?no.10～11所示的內引物、seq?idno.12～13所示的環引物和seq?id?no.14所示的探針；

5、(3)seq?id?no.15～16所示的外引物、seq?id?no.17～18所示的內引物、seq?idno.19～20所示的環引物和seq?id?no.21所示的探針；

6、(4)seq?id?no.22～23所示的外引物、seq?id?no.24～25所示的內引物、seq?idno.26～27所示的環引物和seq?id?no.28所示的探針；

7、(5)seq?id?no.29～30所示的外引物、seq?id?no.31～32所示的內引物、seq?idno.33～34所示的環引物和seq?id?no.35所示的探針；

8、(6)seq?id?no.36～37所示的外引物、seq?id?no.38～39所示的內引物、seq?idno.40～41所示的環引物和seq?id?no.42所示的探針；

9、(7)seq?id?no.43～44所示的外引物、seq?id?no.45～46所示的內引物、seq?idno.47～48所示的環引物和seq?id?no.49所示的探針；以及

10、(8)seq?id?no.50～51所示的外引物、seq?id?no.52～53所示的內引物、seq?idno.54～55所示的環引物和seq?id?no.56所示的探針。

11、本發明中，所述碳青霉烯類耐藥基因選自：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶kpc基因、新德里金屬β-內酰胺酶ndm基因、苯唑西林酶oxa-48基因、維羅納整合子編碼的金屬內酰胺酶vim基因、以及亞胺培南酶imp基因；所述常見cro選自：肺炎克雷伯菌kp、銅綠假單胞菌pa、以及鮑曼不動桿菌ab。

12、進一步的，所述(1)的引物和探針用于檢測kpc基因，所述(2)的引物和探針用于檢測ndm基因，所述(3)的引物和探針用于檢測oxa-48基因，所述(4)的引物和探針用于檢測vim基因，所述(5)的引物和探針用于檢測imp基因，所述(6)的引物和探針用于檢測kp，所述(7)的引物和探針用于檢測pa，所述(8)的引物和探針用于檢測ab。

13、根據本發明的優選實施例，所述seq?id?no.7、seq?id?no.14、seq?id?no.21、seqid?no.28、seq?id?no.35、seq?id?no.42、seq?id?no.49、以及seq?id?no.56所示的靶標探針，其5′端或近5′端堿基t上修飾有fam熒光基團，3′端修飾有bhq1淬滅基團、且3′端第3或第4個堿基修飾為rna堿基。

14、本發明的第二個方面，提供了一種用于檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的引物和探針組合。

15、進一步的，所述試劑盒還包括用于檢測內標基因的、seq?id?no.57～58所示的外引物、seq?id?no.59～60所示的內引物、seq?id?no.61～62所示的環引物和seq?id?no.63所示的探針。

16、根據本發明，所述內標基因為gapdh基因。

17、優選的，seq?id?no.63所示的內標探針，其5′修飾有rox熒光基團，3′端修飾有bhq2淬滅基團、且3′端第3個堿基修飾為rna堿基。

18、本發明的第三個方面，提供了一種檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的方法，所述方法包括使用如上所述的引物和探針組合或者試劑盒，對待測樣品進行lamp擴增反應，根據擴增結果確定待測樣品是否含有碳青霉烯類耐藥基因或常見cro。

19、根據本發明的優選實施例，所述lamp擴增反應為雙重實時熒光lamp，包括利用如上所述的lamp引物和探針組合對待測樣本dna進行擴增，若對應的靶標產生s型擴增曲線則該靶標為陽性，若無s型擴增曲線則為陰性。

20、本發明提供的上述引物和探針組合的特異性好、靈敏度高，可以用于青霉烯酶類5種常見的耐藥基因(kpc、ndm、oxa48、vim、imp)的檢測及對常見的產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌kp、銅綠假單胞菌pa、以及鮑曼不動桿菌ab進行鑒定，為碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌感染的臨床治療提供一定的依據。

技術特征：

1.一種用于檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的引物和探針組合，其特征在于，所述引物和探針組合為lamp擴增所需，包括：

2.根據權利要求1所述的引物和探針組合，其特征在于，所述碳青霉烯類耐藥基因選自：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶kpc基因、新德里金屬β-內酰胺酶ndm基因、苯唑西林酶oxa-48基因、維羅納整合子編碼的金屬內酰胺酶vim基因、以及亞胺培南酶imp基因；所述常見cro選自：肺炎克雷伯菌kp、銅綠假單胞菌pa、以及鮑曼不動桿菌ab。

3.根據權利要求2所述的引物和探針組合，其特征在于，所述(1)的引物和探針用于檢測kpc基因，所述(2)的引物和探針用于檢測ndm基因，所述(3)的引物和探針用于檢測oxa-48基因，所述(4)的引物和探針用于檢測vim基因，所述(5)的引物和探針用于檢測imp基因，所述(6)的引物和探針用于檢測kp，所述(7)的引物和探針用于檢測pa，所述(8)的引物和探針用于檢測ab。

4.根據權利要求1所述的引物和探針組合，其特征在于，所述seq?id?no.7、seq?idno.14、seq?id?no.21、seq?id?no.28、seq?id?no.35、seq?id?no.42、seq?id?no.49、以及seq?id?no.56所示的靶標探針，其5′端或近5′端堿基t上修飾有fam熒光基團，3′端修飾有bhq1淬滅基團、且3′端第3或第4個堿基修飾為rna堿基。

5.一種用于檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1～4中任一項所述的引物和探針組合。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括用于檢測內標基因的、seq?idno.57～58所示的外引物、seq?id?no.59～60所示的內引物、seq?id?no.61～62所示的環引物和seq?id?no.63所示的探針。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述內標基因為gapdh基因。

8.根據權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，seq?id?no.63所示的內標探針，其5′修飾有rox熒光基團，3′端修飾有bhq2淬滅基團、且3′端第3個堿基修飾為rna堿基。

9.一種檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見cro的方法，其特征在于，所述方法包括使用權利要求1～4中任一項所述的引物和探針組合或者權利要求5～8中任一項所述的試劑盒，對待測樣品進行lamp擴增反應，根據擴增結果確定待測樣品是否含有碳青霉烯類耐藥基因或常見cro。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述lamp擴增反應為雙重實時熒光lamp，包括利用權利要求1所述的lamp引物和探針組合對待測樣本dna進行擴增，若對應的靶標產生s型擴增曲線則該靶標為陽性，若無s型擴增曲線則為陰性。

技術總結
本發明公開了一種用于檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見CRO的引物和探針組合，所述引物和探針組合為LAMP擴增所需，所述碳青霉烯類耐藥基因選自：KPC基因、NDM基因、OXA?48基因、VIM基因、以及IMP基因；所述常見CRO選自：KP、PA、以及AB。本發明還公開了用于檢測碳青霉烯類耐藥基因及常見CRO的試劑盒及檢測方法。本發明提供的引物和探針組合的特異性好、靈敏度高，可以用于青霉烯酶類5種常見的耐藥基因的檢測及對常見的產碳青霉烯酶的KP、PA、以及AB進行鑒定，為碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌感染的臨床治療提供一定的依據。

技術研發人員：唐雪明,張清連,許向華
受保護的技術使用者：上海硅羿生物技術有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24