本發明屬于基因工程，具體涉及一種靶向家蠶絲膠1基因的grna、粗蠶絲制備方法與應用。

背景技術：

1、蠶絲，又稱天然絲，是熟蠶結繭時所分泌絲液凝固而成的連續長纖維，主要由絲素和絲膠組成。作為人類利用最早的動物纖維之一，蠶絲具有輕柔、細長、光澤好、手感滑爽豐滿等特點。而中國作為蠶絲的發源地，是全球最主要的蠶絲生產國，蠶絲產區極廣，包括江蘇、浙江、四川、廣東和山東等省份。

2、不同粗細的蠶絲的應用場景具有一定差異。細蠶絲具有較好的的保溫隔熱性能，多被用于制作保溫服以及隔熱材料領域。而直徑增加的粗蠶絲，通常防水性增強，可用于：1)漁具、船帆等防水材料：粗蠶絲可用于制作韌性優良的魚線并減少魚線的吸水浸泡，從而延長漁具的使用壽命；也可以添加到船帆、潛水服的制作材料中，因其柔韌性而進一步提升使用體驗。2)工業過濾材料：粗蠶絲可以加工成為過濾材料，由于其纖維較粗，相互之間具有一定的孔隙結構，可以起到初步過濾的作用。3)醫療領域：粗蠶絲由于其吸水性較差，可以用做手術縫合線，不影響周圍組織液的流動，也可用作組織修復材料，粗蠶絲支架可以為細胞提供生長的空間和支撐，促進組織的再生和修復。

3、傳統蠶絲以及已存在的技術都更關注于蠶絲的力學性能，對于絲直徑的變化關注較少。傳統的通過優化蠶的飼養條件或者是改變飼料來獲得粗蠶絲的方法用時緩慢，效果不穩定，帶來的經濟效益較低。而在飼養過程中進行人為篩選，從而形成吐出粗蠶絲的“新品系”家蠶則費時費力，得到的蠶絲增粗率波動大。利用物理或化學處理使蠶絲增粗則可能會影響蠶絲所具備的其他優良性能，不利于后續開發。

4、crispr/cas9基因編輯技術是一種利用細菌源的crispr序列和cas9核酸酶，通過設計特定的引導rna(sgrna)精確定位并切割目標基因序列，實現基因敲除、插入或替換的革命性分子生物學工具。crispr/cas9技術已經廣泛的應用于蠶絲性能改變方面。例如，現有研究人員曾利用該技術生產重組蜘蛛絲蛋白的方案，并成功獲得了機械性明顯改善的家蠶-蜘蛛嵌合絲。又如，公開號為cn115820736b的專利公開了一種家蠶絲膠蛋白ser4在提高蠶絲性能中的應用及其方法，其通過無縫克隆和同源重組，將分子量超過250kda的完整ser4蛋白表達到了蠶繭絲膠層中，育成的轉基因品系提高了蠶絲力學性能的提高，過表達ser4品系的蠶絲更加疏水，蠶繭脫膠率減低。再如，公開號為cn117802107a的專利公開了一種家蠶bmeckl1基因在高絲量家蠶品種選育中的應用，其通過在家蠶中敲除bmeckl1,可以提高中部絲腺及后部絲腺的大小，顯著提高全繭量和繭層率，進而得到蠶絲產量提高的雄性家蠶品種，因此bmeckl1敲除可以用于創制高絲量突變體，應用于家蠶高絲量新品種的選育。現有技術多將crispr/cas9基因編輯技術應用側重于對于蠶絲性能的研究。

5、絲膠是蠶繭的重要組成部分，約占25％，起著膠粘和保護絲素的作用。家蠶絲膠1基因(bmser1)是編碼絲膠蛋白的關鍵基因之一，基因大小約23.6kb，位于家蠶第11號染色體，在基因組中以單拷貝形式存在，含有9個外顯子，其在家蠶中部絲腺的后區和中區表達，具有5種選擇性剪切模式，編碼分子量約為70～330kda的多種蛋白質，位于包裹繭絲纖維的絲膠蛋白層的里層。調控絲膠基因的表達水平，可以改變絲膠蛋白在繭絲中的占比，進而改變脫膠后蠶絲纖維的直徑。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明提出了一種靶向家蠶絲膠1基因的grna、粗蠶絲制備方法與應用。本發明通過基因編輯技術敲除家蠶bmser1基因，得到bmser1基因敲除的雜合突變家蠶品系；該轉基因蠶可穩定產出直徑更粗的粗蠶絲。本發明從可遺傳的角度為穩定得到直徑增粗的蠶絲提供一種可行的方法。

2、本發明的目的之一在于提供一種靶向家蠶bmser1基因的grna。

3、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

4、靶向家蠶bmser1基因的grna，所述grna的靶序列如seq?id?no：1所示。

5、本發明的目的之二在于提供一種由前述grna構建的轉基因表達載體。

6、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

7、由前述grna構建的轉基因表達載體。

8、所述轉基因表達載體的制備方法如下：在所述grna兩邊加入粘性末端，使用bbsi酶切grna骨架載體后，與退火引物進行連接轉化，獲得piggybac[3xp3-egfp-sv40；u6-grna-sv40]轉基因載體；所述退火引物包括核苷酸序列如seq?id?no：4所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no：5所示的反向引物。

9、本發明的目的之三在于提供一種用于敲除家蠶bmser1基因的crispr/cas9基因編輯系統。

10、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

11、用于敲除家蠶bmser1基因的crispr/cas9基因編輯系統，所述crispr/cas9基因編輯系統包括前述轉基因表達載體和cas9表達載體。

12、本發明的目的之四在于提供一種bmser1基因敲除的雜合突變家蠶品系的制備方法。

13、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

14、bmser1基因敲除的雜合突變家蠶品系的制備方法利用前述crispr/cas9基因編輯系統敲除家蠶中bmser1基因，篩選雙元轉基因個體，獲得雜合突變家蠶品系。

15、作為優選，所述方法包括如下步驟：

16、(1)構建靶向家蠶bmser1基因的grna表達載體，并制備grna轉基因家蠶；

17、(2)將grna轉基因家蠶和cas9轉基因家蠶進行雜交，篩選得到眼部和身體同時發綠色熒光的雙元轉基因個體；

18、(3)對步驟(2)所得雙元轉基因個體進行分型檢測，篩選得到bmser1基因敲除的雜合突變家蠶品系。

19、作為優選，步驟(3)中，分型檢測所用引物包括：核苷酸序列如seq?id?no：2所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no：3所示的反向引物。

20、本發明的目的之五在于提供一種粗纖維蠶絲的制備方法。

21、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

22、粗纖維蠶絲的制備方法，采用前述方法制備bmser1基因敲除的雜合突變家蠶品系，通過飼養轉基因蠶獲得粗蠶絲。

23、本發明的目的之六在于提供一種前述grna、前述轉基因表達載體和/或前述基因編輯系統在培育粗蠶絲轉基因家蠶品系和/或制備粗蠶絲中的應用。

24、本發明的目的之七在于提供一種敲除家蠶bmser1基因在培育粗蠶絲轉基因家蠶品系和/或制備粗蠶絲中的應用。

25、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

26、敲除家蠶bmser1基因在培育粗蠶絲轉基因家蠶品系和/或制備粗蠶絲中的應用

27、作為優選，所述bmser1基因的核苷酸序列如seq?id?no：6所示。

28、作為優選，利用前述基因編輯系統敲除家蠶中bmser1基因，獲得粗蠶絲轉基因家蠶品系；通過飼養轉基因蠶，獲得粗蠶絲。

29、本發明的有益效果在于：

30、(1)本發明使用基因編輯技術改變家蠶遺傳學性狀，從而可以通過飼養家蠶得到穩定遺傳的吐出粗絲的蠶，后續生產開發中只需要飼養轉基因蠶即可以獲得穩定產量的粗蠶絲。本發明所得粗蠶絲具有更低的絲膠率和更粗的直徑：雜合突變體絲膠率約為13.83％，相較于對照組降低約11.37個百分點；雜合突變體脫膠蠶絲的直徑約為15.24μm，相較于對照組直徑增粗3.91μm。本發明為蠶絲直徑增粗提供了一種可實現的方法，并且該方法在防水材料、漁具制造、工業過濾材料及組織修復等領域具有廣闊的應用前景。

31、(2)本發明制得的粗蠶絲不僅保持了蠶絲的優良光澤度，并且耐磨性和抗拉強度方面都具有優勢，增加了耐用性。該粗蠶絲可用于增強漁具、釣魚線的抗浸泡能力，延長漁具壽命；由于粗蠶絲兼具優異的防水性及柔韌性，可進一步制造更貼合的雨衣或者防水衣物。