本發明涉及一種茴芹果藥材中異葒草苷的含量測定方法，屬于醫藥檢測。

背景技術：

1、茴芹果為傘形科屬植物茴芹pimpinella?anisum?l.的干燥成熟果實，具消散寒氣，促進機體自然隨和，利尿通經，潤腸止痛等功效，用于呼吸困難，平咳止喘等病癥。《保健藥園》：“祛寒止痛，平咳止喘”；《注醫典》：“主治呼吸困難；《拜地依藥書》：“治療乃孜來感冒”。茴芹果藥材含有大量的黃酮和糖類、揮發油等成分。該藥材質量標準在2023年納入國家藥品標準，但僅僅只有來源、性狀、鑒別、檢查等項目進行了限定，缺乏有效成分的含量測定方法。現有公開的文獻（吐送江·阿不都艾尼,王亞麗,沙拉麥提·艾力.茴芹果質量標準研究[j].中國民族醫藥志,2013,19(08):51-52.）針對茴芹果藥材的質量控制公開了總黃酮的含量測定方法，選用蘆丁為對照品(指標成分)，屬于大類成分檢測，由于黃酮類化合物種類繁多、成分復雜，且茴芹果中不存在蘆丁。僅對蘆丁這一種成分進行定量分析未必能反映藥材中總黃酮的實際含量，存在一定的局限性，且總黃酮的含量并不能區分不同產地、不同采收期的不同。

2、國外有研究報道，茴芹果中存在異葒草苷，是一種木犀草素糖苷類天然黃酮物質。研究發現異葒草苷具有通過減少炎癥因子，降低氧化應激，達到改善肺功能、減緩肺損傷的療效；異葒草苷存在抗呼吸道合胞病毒活性、對脂多糖誘導的急性肺損傷存在保護作用、能夠減輕細胞炎癥反應。該作用與茴芹果藥材療效相一致。本發明首次以異葒草苷為指標成分，建立其含量測定方法，為進一步完善茴芹果藥材的質量標準提供參考依據。現有文獻“hplc測定叢生竹中總黃酮及(異)牡荊苷、(異)葒草苷的含量”公開了一種叢生竹中異葒草苷的含量測定方法，該方法采用了等度洗脫法測定了禾本科植物中的竹亞科植物叢生竹中異葒草苷的含量。在前期研究中，我們使用等度洗脫法嘗試測定茴芹果中異葒草苷的含量發現分離效果差、難以優化條件，分析時間長。因此在現有公開文獻的基礎上，建立了全新的茴芹果藥材中異葒草苷的含量測定方法。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題為針對現有技術中缺乏對茴芹果有效成分的含量測定方法，沒有完善的茴芹果藥材的質量標準提供參考依據。為此，提供一種茴芹果藥材中異葒草苷的含量測定方法。其以異葒草苷為測定指標，采用高效液相色譜法，建立茴芹果藥材的含量測定方法，為茴芹果藥材的質量標準研究提供依據。該方法測定方法準確，靈敏度高，重復性好，結果可靠，為茴芹果質量控制和評價提供依據。

2、本發明提供了一種茴芹果藥材中異葒草苷的檢測方法，其包括以下步驟：

3、采用高效液相色譜法，對茴芹果藥材提取物進行檢測，色譜條件包括：

4、色譜柱為c18柱；

5、流動相為流動相a和流動相b；

6、所述流動相b為磷酸水溶液，所述磷酸水溶液中的磷酸體積百分比為0.01~0.3%，所述流動相a為甲醇。

7、在某一方案中，所述茴芹果藥材提取物的制備方法包括如下步驟：將茴芹果藥材和溶劑進行混合、提取、冷卻、補足減失重量、過濾，即得所述茴芹果藥材提取物；

8、所述溶劑為醇類溶劑和水。

9、在某一方案中，所述茴芹果藥材的來源可為甘肅酒泉；所述茴芹果藥材為傘形科植物茴芹。

10、在某一方案中，所述茴芹果藥材與所述溶劑的質量體積比為0.03g/ml~0.3?g/ml，例如0.03?g/ml、0.05?g/ml或0.1?g/ml。

11、在某一方案中，所述溶劑為50%~100%甲醇，優選為50%、70%或100%；所述百分比是指甲醇在溶劑中的質量百分比。

12、在某一方案中，所述提取的方式為超聲處理、回流處理或冷浸法，優選為回流處理。

13、在某一方案中，所述回流處理時間為15~40min，優選為20min、30min或40min。例如30min。

14、在某一方案中，所述冷卻為自然冷卻至室溫。

15、在某一方案中，所述補足減失重量時一般采用所述茴芹果提取后的溶液中的溶劑。

16、在某一方案中，所述過濾為使用有機濾膜進行過濾，優選為0.45μm有機濾膜過濾。

17、在某一方案中，所述茴芹果藥材提取物的制備方法優選包括如下步驟：將所述茴芹果藥粉（過二號篩）1g與所述10ml~30ml的50%~100%甲醇進行混合，回流提取15~40min，待混合液冷卻至室溫后，用所述70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得所述茴芹果藥材提取物；

18、進一步優選為將所述茴芹果藥粉（過二號篩）1g，精密稱定，置于150ml具塞錐形瓶中，加入70%甲醇10ml，稱重，回流提取30分鐘，待樣品冷卻至室溫后，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得所述茴芹果藥材提取物。

19、在某一方案中，使用異葒草苷為對照品，在檢測前還包括對照品溶液的制備：將所述異葒草苷溶解于甲醇溶液；所述異葒草苷與所述甲醇溶液的質量體積比為（3.2~64）μg/ml，例如12.8216μg/ml。

20、在某一方案中，所述流動相a中的甲醇為色譜純。

21、在某一方案中，所述色譜柱為waters?c18色譜柱、agilent?c18色譜柱或gl?c18色譜柱，例如agilent?c18色譜柱。

22、在某一方案中，所述檢測方法中，所述色譜柱長度為250mm；

23、所述色譜柱的內徑為4.6mm；

24、所述色譜柱的填料粒徑為5μm。

25、在某一方案中，所述檢測方法中，所述色譜柱為柱長為250mm、內徑為4.6mm、填料的顆粒的粒徑為5μm的agilent?c18色譜柱。

26、在某一方案中，所述檢測方法中，高效液相色譜儀可為thermo?scientificultimate3000、thermo?scientificvanquish、waters?e2695/2998高效液相色譜儀，例如thermo?scientific?ultimate3000。

27、在某一方案中，所述檢測方法中，檢測波長為345~350nm，例如347nm。

28、在某一方案中，所述檢測方法中，進樣量為5~20μl，例如10μl。

29、在某一方案中，所述檢測方法中，柱溫為10~40℃，優選為25～35?℃，例如25°c、30°c或35°c，優選為35°c。

30、在某一方案中，所述流動相的流速為0.1~2?ml/min，優選為0.8?~1.2?ml/min，例如1.0?ml/min。

31、在某一方案中，所述檢測方法中，洗脫方式為梯度洗脫。

32、在某一方案中，所述梯度洗脫中，以所述流動相a的總體積為100%計；在0~36min時，所述流動相a的體積分數為28%，所述流動相b的體積分數為72%；在36~45min時，所述流動相a的體積分數遞增至37%，所述流動相b的體積分數遞減至63%；在45~48min時，所述流動相a的體積分數遞增至90%，所述流動相b的體積分數為10%；在48~51min時，所述流動相a的體積分數為90%，所述流動相b的體積分數為10%；在51~55min時，所述流動相a的體積分數遞減至28%，所述流動相b的體積分數遞增至72%。

33、在某一方案中，所述色譜柱為柱長為250mm、內徑為4.6mm、填料粒徑為5μm的agilent?c18色譜柱；

34、所述檢測波長為347nm；

35、所述柱溫為35°c；

36、所述流動相的流速為1.0?ml/min；

37、所述進樣量為10μl；

38、所述流動相為甲醇（a）-0.1%磷酸溶液（b）；

39、所述梯度洗脫為：

40、

41、其中，表格中的百分比為各組分分別占流動相a和流動相b總體積的體積百分比；

42、所述高效液相色譜儀為thermo?scientific?ultimate3000。

43、在某一方案中，所述茴芹果藥材中異葒草苷的檢測方法為：

44、所述色譜條件為：agilent?c18色譜柱，4.6mm×250mm，2.5μm；流動相：流動相a為甲醇，流動相b為0.01~0.3%磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測波長：345~350nm；柱溫：10~40℃；流速：10~40℃；進樣量：5~20μl；

45、在檢測前對照品溶液的制備為：精密稱取異葒草苷對照品，置容量瓶中，加甲醇溶液配成（3.2~64）μg/ml；

46、所述茴芹果藥材提取物的制備方法為：將所述茴芹果藥粉（過二號篩）1g與所述10ml~30ml的50%~100%甲醇進行混合，回流提取15~40min，待混合液冷卻至室溫后，用所述70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得所述茴芹果藥材提取物。

47、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。

48、本發明所用試劑和原料均市售可得。

49、本發明的積極進步效果在于：

50、本發明以異葒草苷為檢測指標，采用高效液相色譜法，建立茴芹果藥材的含量測定方法，以茴芹果藥材的質量標準研究提供實驗依據；所述測定方法準確，加樣回收rsd小于1.4%；靈敏度高，信噪比（s/n）不小于3，可達10；精密度小于1.4%；重復性好，結果可靠，為茴芹果藥材質量控制和評價提供依據。