本發明涉及一種抗菌肽制劑、制備方法及其應用。
背景技術：
目前，在臨床上的病菌感染相當嚴重，近20年來它己經成為威脅人類健康的一大殺手。而且，越來越多的細菌可以抵御抗生素的治療，從而對公眾健康造成了嚴重的威脅。在美國，1998年因為耐藥性細菌感染而失去的生命比在越南戰場上還要多。一度輕而易舉就可以被抗生素殺死的病菌如：金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌等，現在因為產生了耐藥性而變得越來越兇悍，讓人越來越束手無策。而其中的耐藥性金黃色葡萄球菌是其中最為活躍的分子，由它引起的感染，不僅在常規治療下療效欠佳或完全無效，同時還可以改變病人的正常菌群的生態狀況，從而給病人造成額外的痛苦，增加經濟負擔和不幸。
目前市面上常用抗菌劑有含氯類、醛類、醇類、碘類、酚類以及季銨鹽類等，存在對皮膚粘膜有刺激作用，或者抗菌譜窄，或者長期會產生細菌耐藥等問題。特別是應用于敏感部位的抗菌劑對制劑配方要求更高，如女性私密部位專用抗菌劑。女性私密部位常發生細菌性、霉菌性、滴蟲性及非特異性陰道炎、宮頸炎、外陰炎、陰部瘙癢等癥。而由于這些部位的敏感性，對治療藥物要求更高，常見現有消毒劑會對皮膚粘膜產生刺激，抑菌譜不夠廣或者由于抗菌機制本身原因容易導致細菌耐藥性不適用長期使用和預防使用，現有消毒劑存在諸多缺點無法滿足上述要求。
技術實現要素：
本發明的目的是公開一種生物抗菌多肽制劑、制備方法及其應用，以克服現有技術存在的缺陷。
所述的生物抗菌多肽制劑，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
生物抗菌肽BQ 0.1％-10％；
聚六亞甲基雙胍(PHMB) 0.01-1％
優選的，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
生物抗菌肽BQ 0.1％-2％；
聚六亞甲基雙胍(PHMB) 0.01-0.5％
所述生物抗菌肽BQ是氨基酸序列為Lys Trp Lys Ser Phe Ile Lys Lys Leu Thr Ser Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe的多肽，所述生物抗菌肽BQ的制備、純化及性質已經在授權公告號CN101570569B發明專利中，有具體的記載；
所述生物抗菌肽BQ是一種生物蛋白，在液體制劑中，要保持其蛋白活性非常重要，而一般化學試劑，尤其是高分子材料，表面活性劑成份對蛋白活性均會造成影響；
發明人發現，聚六亞甲基雙胍為一種對該抗菌肽BQ活性不具有影響的化合物，兩者可以聯合使用。聚六亞甲基雙胍本身是一種良好的廣譜殺菌劑，其與抗菌肽BQ聯合使用，可以極大的發揮制劑的抗菌效果。聚六亞甲基雙胍濃度極低(重量含量萬分之一)的情況下就可以維持好抗菌肽BQ的蛋白活性，使得抗菌肽BQ的效應發揮最大；
進一步優選的，所述的生物抗菌多肽制劑，以水為載體，還包括醫藥學上可接受的輔料，磷酸鹽，如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀；保護劑，如甘氨酸；穩定劑，如殼聚糖；潤膚劑，如甘油；無機鹽，如氯化鈉、氯化鉀；
進一步優選的，所述的生物抗菌多肽制劑，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
最優選的，以水為載體，含有如下重量百分比的組分：
本發明的制備方法，包括如下步驟：
(1)將所述的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀溶解于水中，獲得溶液A；
(2)將生物抗菌肽BQ、聚六亞甲基雙胍和甘氨酸，溶于溶液A，然后將殼聚糖、氯化鈉溶于水中，得到溶液B；
(3)將上述溶液A和溶液B混合后，加入甘油，即可獲得所述的生物抗菌多肽制劑；
動物試驗證明，所述的生物抗菌多肽制劑，具有十分好的滅菌效果，尤其對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌和病毒，更具有明顯的殺滅作用，可廣泛、安全、實用地用于手、皮膚、粘膜的消毒，以及家庭、餐館、賓館酒店、公共交通工具、幼兒園、醫院等場合中包括食飲具在內的一般物品表面的消毒，和空氣消毒、動物消毒、寵物消毒等。
所述的生物抗菌多肽制劑，可通過浸漬、涂抹、噴灑途徑施加于需要消毒的部位，劑量一般為一日1-3次，每次使用量為能均勻覆蓋消毒表面部位。
本發明所述的生物抗菌多肽制劑，抗菌肽BQ與聚六亞甲基雙胍復配物并不是兩種物質功能簡單疊加，而是具有協同增強作用，復配物的殺菌效果2-20倍于兩者殺菌效果的簡單疊加。復配物的殺菌譜也明顯擴大，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和常見病毒，尤其是對一般殺菌劑都較難處理的耐藥性革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可達到很好的殺滅效果。
本發明生物抗菌多肽制劑的有益效果是：
1、殺菌效果好。該制劑核心殺菌成份為新型抗菌肽，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌均具有很強的殺菌作用。體外實驗作用2分鐘即可達到99.9％的殺菌率，如果作用5分鐘～10分鐘，可使殺菌率達到100％。
2、安全性高：制劑核心殺菌成份為生物蛋白，即使經組織吸收后很快就會降解為氨基酸，對人體不會產生毒性或者殘留問題。
3、穩定性強。本品在25℃常溫保存六個月，生物活性基本沒有改變。本品在4～8℃可以保存2年。
4、可做預防用藥：本發明主要作用組分為生物制劑，克服了傳統化學類制劑對粘膜具有刺激性，細菌容易產生耐藥性的缺點。易被機體所接受，且沒有任何毒副作用。適用于長期使用或者預防用藥。
具體實施方式
實施例1
1、組成和配比：(重量百分比)
生物抗菌肽BQ 0.1％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)1％；甘氨酸1％；殼聚糖1％；甘油1％；磷酸二氫鉀1％；磷酸氫二鈉1％；氯化鈉0.1％；其余用蒸餾水。
2、配制步驟
(1)將磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，溶于蒸餾水中，得到溶液A；
(2)按照制劑處方，稱取所需的生物抗菌肽BQ、聚六亞甲基雙胍和甘氨酸，加入到部分A溶液中，攪拌并使溶解，得到溶液B。
(3)按配比稱取殼聚糖、氯化鈉溶于蒸餾水中，得到溶液C；
(4)將上述溶液B和溶液C混合后，加入甘油，攪拌均勻，即得成品。
分裝于塑料或者玻璃瓶中直接作為消毒液使用；也可分裝于帶手動泵的噴霧瓶中，制備成消毒噴霧劑；也可作為濕巾添加液吸附于無紡布中，制成衛生濕巾。
實施例2
1、組成和配比：(重量百分比)
生物抗菌肽BQ 10％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)0.01％；甘氨酸8％；殼聚糖10％；甘油5％；磷酸二氫鉀20％；磷酸氫二鈉30％；氯化鈉2％；其余用蒸餾水，各組份的重量百分比總和為100％。
2、制備方法同實施例1；
分裝于塑料或者玻璃瓶中直接作為消毒液使用；也可分裝于帶手動泵的噴霧瓶中，制備成消毒噴霧劑；也可作為濕巾添加液吸附于無紡布中，制成衛生濕巾。
實施例3
1、組成和配比
生物抗菌肽BQ 2％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)0.02％；甘氨酸2％；殼聚糖2％；甘油3％；磷酸二氫鉀10％；磷酸氫二鈉20％；氯化鈉1％；其余用蒸餾水，各組份的重量百分比總和為100％。
2、制備方法同實施例1。
分裝于塑料或者玻璃瓶中直接作為消毒液使用；也可分裝于帶手動泵的噴霧瓶中，制備成消毒噴霧劑；也可作為濕巾添加液吸附于無紡布中，制成衛生濕巾。
實施例4
1、組成和配比
生物抗菌肽BQ 1％；聚六亞甲基雙胍(PHMB)0.01％；甘氨酸8％；殼聚糖10％；甘油80％；磷酸二氫鉀5％；磷酸氫二鈉10％；氯化鈉0.75％；其余用蒸餾水，各組份的重量百分比總和為100％。
2、制備方法同實施例1。
分裝于塑料或者玻璃瓶中作為涂抹劑使用。
實施例5
下表是抗菌肽BQ與抗菌肽BQ復配物對各種微生物的殺滅作用比較(對微生物殺菌率試驗按GB 15979-2002＿1＿2002-03-05＿0相關規定進行試驗)：
由上表可知抗菌肽BQ與聚六亞甲基雙胍復配物的殺菌作用并不是兩種物質殺菌作用的簡單疊加，抗菌肽BQ與聚六亞甲基雙胍聯合使用，可以極大的發揮抗菌肽BQ的抗菌效果。且聚六亞甲基雙胍濃度極低(重量含量萬分之一)的情況下就可以維持好抗菌肽BQ的蛋白活性，并使得抗菌肽BQ有效作用濃度降低，仍可以達到同樣高效的殺菌效果。
實施例6
本發明生物抗菌多肽制劑的臨床試用報告說明其功效：
試驗一：生物抗菌多肽制劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌殺菌實驗
一、器材
1、試驗菌：金黃色葡萄球菌第6代(軍事醫學科學院消毒檢測中心提供)、大腸桿菌笫6代(軍事醫學科學院消毒檢測中心提供)
2、樣品：實施例1的生物抗菌多肽制劑
3、中和劑：2％組氨酸、8％卵磷臘、10％吐溫-80的D/E肉湯
4、PBS：0.03mol/L磷酸鹽緩沖液
5、GNP-9160型隔水式恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)
6、培養基：普通營養瓊脂
7、機械秒表(504型)
8、可調恒溫水浴箱(CBN28-3)
二、方法
1、檢驗依據：《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979-2002附錄C3
2、中和劑鑒定試驗：試驗菌株：金黃色葡萄球菌樣品濃度：1：20稀釋液，作用時間：0.5min
3、定量殺菌試驗：樣品濃度：1:20稀釋液
4、試驗溫度20℃，試驗重復3次
三、結果
1、中和劑鑒定試驗結果表明：笫1、2組生長茵落數分別為0cfu/mL和4.47*102cfu/mL，第3、4、5組三組間誤差率分別為7.80％、9.72％、4.08％。
表1中和劑鑒定試驗結果
2、試驗溫度20℃時，樣品1：:2稀釋液作用2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺菌率均為100％。
表2對實驗菌殺菌效果
實施例7
試驗二：實施例1的生物抗菌多肽制劑對白色念珠菌殺菌實驗
一、器材
1、試驗菌：白色念珠菌第6代(軍事醫學科學院消毒檢測中心提供)
2、樣品：生物抗菌多肽制劑
3、中和劑：2％組氨酸、8％卵磷臘、10％吐溫-80的D/E肉湯
4、PBS：0.03mol/L磷酸鹽緩沖液
5、GNP-9160型隔水式恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)
6、培養基：沙氏培養基
7、機械秒表(504型)
8、可調恒溫水浴箱(CBN28-3)
二、方法
1、檢驗依據：《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979-2002附錄C3
2、中和劑鑒定試驗：樣品濃度：原液，作用時間：0.5min
3、定量殺菌試驗：樣品濃度：原液
4、試驗溫度20℃，試驗重復3次
三、結果
1、中和劑鑒定試驗結果表明：笫1、2組生長茵落數分別為0cfu/mL和1.06*103cfu/mL，第3、4、5組三組間誤差率分別為7.78％、13.83％、9.08％。
表3中和劑鑒定試驗結果
2、試驗溫度20℃時，樣品1：:2稀釋液作用2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘對白色念珠菌的殺菌率均為100％。
表4對實驗菌殺菌效果
實施例8
試驗三：實施例3的生物抗菌多肽制劑對流感病毒的殺菌實驗
1、材料與方法
1.1測試樣品：實施例3的生物抗菌多肽制劑。
1.2試驗菌株：
流感病毒(H3N2)
1.3試驗依據：
衛生部《消毒技術規范》中相應規定。
2、對流感病毒的滅活試驗結果
在試驗溫度為20℃±1℃條件下，經3次重復試驗證明，測試樣品原液作用5.0min，對流感病毒平均殺滅對數值>5.00。(結果見表5)
表5對流感病毒的滅活效果
注：陽性對照平均對數值及范圍4.32(4.23-4.50)。
實施例9
試驗三：實施例2的生物抗菌多肽制劑陰道粘膜刺激性試驗
―、材料和動物
1、受試物：樣品為無色液體，取樣品原液作為受試物，
2、動物：健康雌性新西蘭白兔6只，普通級，金陵種兔場提供，合格證號：SCXK(蘇)2012—0003號，體重2.0-2.4kg。
3.試驗條件：動物環境設施合格證號：SYXK(蘇)2012—0036號；環境溫度：22±2℃；相對濕度：40-70％；飼料來源及證號：江蘇省協同醫藥生物工程有限公司，蘇A飼生字(2002)009號。主要儀器：嬰兒秤(05-324)，病理切片機，顯微鏡。
二、方法
1、檢驗依據：衛生部(2002年版)《消毒技術規范》第二部分2.3.5陰道黏膜刺激試驗。
2、試驗方法：動物分入試驗組、對照組，每組3只。動物仰面固定，暴露出會陰和陰道口。將小號消毐導尿管與2mL注射器連接，導管用受試物濕潤后輕柔地插入動物陰道內(4-5cm),并緩慢注入2mL受試物，抽出導管，完成染毐。對照組動物闬生理鹽水作同樣處理，24mL后采用氣栓法處死動物，剖腹取出完整的陰道，縱向切開，肉眼觀察有無充血、水腫等表現，供病理取材時參考，將陰道放入10％福爾馬林中固定24h以上，選取陰道的兩端和中央3個部位的組織制片，HE染色后進行組織病理學檢查。
三、實驗結果
肉眼觀察可見對照組2號和試驗組各動物陰道黏膜輕度致中度水腫。組織病理學觀察結果見下表。
受試物對動物陰道黏膜刺激反應評分
四、結論
受試物對家兔陰道粘膜刺激指數為1.56，陰道粘膜刺激強度為極輕刺激性。