本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種獨角石斛的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
獨角石斛(Dendrobium unicum)，蘭科石斛屬植物。其唇瓣反轉(zhuǎn)似犀牛角，布有橘紅色網(wǎng)紋，非常獨特。雖然它沒有飽滿圓整的花型，但是花瓣橙紅色與唇瓣上筋狀網(wǎng)脈的遺傳使得它異軍突起，逐漸受到追捧。分布于越南、老撾、緬甸和泰國(海拔800-1550米)，生長于低地森林的巖石和小灌木上。花期春季至初夏，花朵壽命長，可達1個月以上。深受人們的喜愛。迄今為止，未見獨角石斛組織培養(yǎng)的報道。
然而由于蘭科種子自然繁殖主要靠分株繁殖，在野外本就很難發(fā)芽，而隨著社會的發(fā)展，人們過度的采摘使得野生的獨角石斛資源大多遭到破壞，幾近滅絕，因此尋找一種組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)獨角石斛，使獨角石斛快速繁殖，實現(xiàn)獨角石斛優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化育苗，滿足人們的需求，成為亟待人們解決的問題。
公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種獨角石斛的組織培養(yǎng)方法，能保持原有品種的優(yōu)良性狀，在短時間內(nèi)培育出大量適合栽培種植的獨角石斛幼苗，單芽增殖系數(shù)達20-30倍以上，且試管苗叢生芽健壯，在生根培養(yǎng)基中容易生根，移栽基質(zhì)后成活率在90％以上。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
一種獨角石斛的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)取獨角石斛的果莢進行消毒和預(yù)處理，先用體積分數(shù)為2％的洗潔精水溶液浸泡5min后，用流水沖洗15-30min，然后將獨角石斛的果莢灼燒2次，每次灼燒5-10s后，得到外植體；
(2)將所述外植體切開，取出種子后接種到第一培養(yǎng)基中，在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，得到無菌試管苗；
(3)將所述無菌試管苗置于第二培養(yǎng)基中，在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)50～70天，得到試管苗叢生芽；
(4)將所述試管苗叢生芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-40天，得到試管苗；
(5)將所述試管苗置于生根培養(yǎng)基中，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-50天，得到組培苗；
(6)煉苗：將所述組培苗和培養(yǎng)所述組培苗的培養(yǎng)瓶一起移出培養(yǎng)室，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向培養(yǎng)瓶中加入30mL的自來水后，自然光照3-5d；
(7)煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)瓶中取出所述組培苗，將所述組培苗的根部洗凈后移栽至基質(zhì)中。
作為優(yōu)選，步驟(1)中將獨角石斛的果莢灼燒2次的具體方法為：在無菌超凈臺內(nèi)將獨角石斛的果莢用無菌鑷夾住，在整個果莢表面沾染體積分數(shù)為75％的酒精，然后灼燒，將酒精燒盡后再重復(fù)灼燒1次。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的第一培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐基氨嘌呤、2.0mg/L的萘乙酸和3g/L的活性炭。
作為優(yōu)選，步驟(3)中所述的第二培養(yǎng)基中包括：MS、0.5-2.0mg/L的甲巰達嗪、0.5-1.5mg/L的萘乙酸和0.2-0.5mg/L的激動素。
作為優(yōu)選，步驟(4)中所述的壯苗培養(yǎng)基中包括：MS、1.0-4.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和1.0-4.0mg/L的萘乙酸。
作為優(yōu)選，步驟(5)中所述的生根培養(yǎng)基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述的土豆泥為將土豆攪碎后得到。
作為優(yōu)選，所述的第一培養(yǎng)基、所述的第二培養(yǎng)基、所述的壯苗培養(yǎng)基以及所述的生根培養(yǎng)基中還含有5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，且所述第一培養(yǎng)基、所述第二培養(yǎng)基、所述壯苗培養(yǎng)基以及所述生根培養(yǎng)基的初始pH值均為5.8。
作為優(yōu)選，步驟(2)-(5)中的培養(yǎng)均為控制光照培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23-27℃，光照強度1500lux，光照時間為8-10h/d。
作為優(yōu)選，步驟(7)中所述的基質(zhì)中樹皮、腐殖質(zhì)土與水苔的體積比為1:1:1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明的方法采用生物技術(shù)對獨角石斛進行組織培養(yǎng)快速繁殖，保持了原有品種的優(yōu)良性狀，能夠在短時間內(nèi)培育出大量適合栽培種植的獨角石斛幼苗，且培養(yǎng)的獨角石斛種苗質(zhì)量好，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，滿足生產(chǎn)上的需要。本發(fā)明中單芽增殖系數(shù)達20-30倍以上，且試管苗叢生芽健壯，接種到生根培養(yǎng)基后容易生根，移栽基質(zhì)后成活率在90％以上。
(2)本發(fā)明的方法中以灼燒的方式對外植體進行滅菌，與傳統(tǒng)的采用升汞滅菌方式相比，既避免了二次污染，又無毒害更環(huán)保。
(3)本發(fā)明的方法中萌發(fā)實驗的第一培養(yǎng)基中添加活性炭，使得第一培養(yǎng)基中的環(huán)境模仿黑暗培養(yǎng)，更有利于種胚發(fā)芽。生根培養(yǎng)基中加入打碎的土豆泥，土豆泥中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)，還有豐富的鉀、鈣、磷、鐵及維生素A，B和C等，既能提供生根所需的營養(yǎng)物質(zhì)，且B12維生素能促進生根，有利于組培苗生根。
(4)獨角石斛的果莢中含有豐富的碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)，還有豐富的鉀、鈣、磷、鐵、鎂等以及多種微量元素，在第一培養(yǎng)基中添加果莢碎，獨角石斛果莢粉碎后和燕麥中的營養(yǎng)物質(zhì)相互互補，共同為胚乳提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進種子發(fā)芽。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述，但應(yīng)當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。
實施例1：
一種獨角石斛的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)取獨角石斛的果莢進行消毒和預(yù)處理，用體積分數(shù)為2％的洗潔精水溶液浸泡5min后，用流水沖洗15min，然后將獨角石斛的果莢灼燒2次，每次灼燒5s后，得到外植體；
(2)將所述外植體切開，取出種子后接種到第一培養(yǎng)基中，在所述第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到無菌試管苗；所述第一培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐基氨嘌呤和2.0mg/L的萘乙酸，3g/L的活性炭；
(3)將所述無菌試管苗置于第二培養(yǎng)基中，在所述第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到試管苗叢生芽；所述第二培養(yǎng)基中包括：MS、1.0mg/L的甲巰達嗪、0.5mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的激動素；
(4)將所述試管苗叢生芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在所述壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到試管苗；所述壯苗培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和4.0mg/L的萘乙酸；
(5)將所述試管苗置于生根培養(yǎng)基中，在所述生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到完整組培苗；所述生根培養(yǎng)基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述土豆泥為將土豆攪碎后得到；
(6)煉苗，煉苗的具體方法為：將所述組培苗和培養(yǎng)所述組培苗的培養(yǎng)瓶一起移出培養(yǎng)室，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向培養(yǎng)瓶中加入30mL的自來水后，自然光照3d；
(7)煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)瓶中取出所述組培苗，將所述組培苗的根部洗凈后移栽至基質(zhì)中，所述基質(zhì)中樹皮、腐殖質(zhì)土與水苔的體積比為1:1:1；
所述的第一培養(yǎng)基、所述的第二培養(yǎng)基、所述的壯苗培養(yǎng)基以及所述的生根培養(yǎng)基中還含有5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，且所述第一培養(yǎng)基、所述第二培養(yǎng)基、所述壯苗培養(yǎng)基以及所述生根培養(yǎng)基的初始pH值均為5.8；
步驟(2)-(5)中的培養(yǎng)均為控制光照培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23℃，光照強度1500lux，光照時間為8-10h/d。
實施例2：
一種獨角石斛的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)取獨角石斛的果莢進行消毒和預(yù)處理，用體積分數(shù)為2％的洗潔精水溶液浸泡5min后，用流水沖洗30min，然后將獨角石斛的果莢灼燒2次，每次灼燒10s后，得到外植體；
(2)將所述外植體切開，取出種子后接種到第一培養(yǎng)基中，在所述第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到無菌試管苗；所述第一培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐基氨嘌呤和2.0mg/L的萘乙酸，3g/L的活性炭；
(3)將所述無菌試管苗置于第二培養(yǎng)基中，在所述第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到試管苗叢生芽；所述第二培養(yǎng)基中包括：MS、1.5mg/L的甲巰達嗪、0.5mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的激動素；
(4)將所述試管苗叢生芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在所述壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到試管苗；所述壯苗培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和4.0mg/L的萘乙酸；
(5)將所述試管苗置于生根培養(yǎng)基中，在所述生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到完整組培苗；所述生根培養(yǎng)基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述土豆泥為將土豆攪碎后得到；
(6)煉苗，煉苗的具體方法為：將所述組培苗和培養(yǎng)所述組培苗的培養(yǎng)瓶一起移出培養(yǎng)室，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向培養(yǎng)瓶中加入30mL的自來水后，自然光照5d；
(7)煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)瓶中取出所述組培苗，將所述組培苗的根部洗凈后移栽至基質(zhì)中，所述基質(zhì)中樹皮、腐殖質(zhì)土與水苔的體積比為1:1:1；
所述的第一培養(yǎng)基、所述的第二培養(yǎng)基、所述的壯苗培養(yǎng)基以及所述的生根培養(yǎng)基中還含有5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，且所述第一培養(yǎng)基、所述第二培養(yǎng)基、所述壯苗培養(yǎng)基以及所述生根培養(yǎng)基的初始pH值均為5.8；
步驟(2)-(5)中的培養(yǎng)均為控制光照培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度27℃，光照強度1500lux，光照時間為8-10h/d。
實施例3：
一種獨角石斛的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)取獨角石斛的果莢進行消毒和預(yù)處理，用體積分數(shù)為2％的洗潔精水溶液浸泡5min后，用流水沖洗20min，然后將獨角石斛的果莢灼燒2次，每次灼燒8s后，得到外植體；
(2)將所述外植體切開，取出種子后接種到第一培養(yǎng)基中，在所述第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后得到無菌試管苗；所述第一培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐基氨嘌呤和2.0mg/L的萘乙酸，3g/L的活性炭；
(3)將所述無菌試管苗置于第二培養(yǎng)基中，在所述第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到試管苗叢生芽；所述第二培養(yǎng)基中包括：MS、2.0mg/L的甲巰達嗪、0.5mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的激動素；
(4)將所述試管苗叢生芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在所述壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，得到試管苗；所述壯苗培養(yǎng)基中包括：MS、3.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和4.0mg/L的萘乙酸；
(5)將所述試管苗置于生根培養(yǎng)基中，在所述生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后得到完整組培苗；所述生根培養(yǎng)基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述土豆泥為將土豆攪碎后得到；
(6)煉苗，煉苗的具體方法為：將所述組培苗和培養(yǎng)所述組培苗的培養(yǎng)瓶一起移出培養(yǎng)室，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向培養(yǎng)瓶中加入30mL的自來水后，自然光照4d；
(7)煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)瓶中取出所述組培苗，將所述組培苗的根部洗凈后移栽至基質(zhì)中，所述基質(zhì)中樹皮、腐殖質(zhì)土與水苔的體積比為1:1:1；
所述的第一培養(yǎng)基、所述的第二培養(yǎng)基、所述的壯苗培養(yǎng)基以及所述的生根培養(yǎng)基中還含有5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，且所述第一培養(yǎng)基、所述第二培養(yǎng)基、所述壯苗培養(yǎng)基以及所述生根培養(yǎng)基的初始pH值均為5.8；
步驟(2)-(5)中的培養(yǎng)均為控制光照培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，光照強度1500lux，光照時間為8-10h/d。
對實施例1-3中單芽的繁殖系數(shù)及所得的組培苗的移栽成活率進行調(diào)查和統(tǒng)計，結(jié)果見表1。
表1本發(fā)明的方法單芽的繁殖系數(shù)及所得的組培苗的移栽成活率測定
由表1可知，本發(fā)明的方法中單芽增殖系數(shù)可達20-30倍，且試管苗叢生芽健壯，接種到生根培養(yǎng)基后容易生根，移栽基質(zhì)后成活率在95％以上。
前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。