一種山葡萄種質資源休眠期抗寒性的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及樹種抗寒性鑒定領域，具體而言，設及一種山葡萄種質資源休眠期抗 寒性的鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 山葡萄（VitisamurensisRupr.)原產中國東北及朝鮮、前蘇聯遠東地區。我國 山葡萄的天然分布區域主要在吉林省長白山、黑龍江省完達山、小興安嶺、迂寧省北部的山 區、半山區、內蒙古烏蘭察布盟W東的大青山亦有分布。它是東北釀造葡萄酒的主要原料， 其酒為紅寶石色，鮮艷透明，具有獨特的風味，深受消費者的歡迎。 W03] 山葡萄是葡萄屬中最抗寒的一個種，枝蔓能耐-40°C的嚴寒，根系可 耐-14~-16°C低溫，對白腐病、白粉病、炭痘病和黑豆病等也有較強的抵抗能力。因此，它 是當前國內外葡萄抗寒育種的最重要資源。
[0004] 山葡萄的抗寒性具有較高的遺傳力，不同的山葡萄資源其抗寒能力差異顯著，快 速、可靠的山葡萄抗寒性相關的指標可為山葡萄抗寒性鑒定和抗寒品種的篩選提供重要依 據。但目前適用于山葡萄抗寒性鑒定的方法尚不明確，對不同來源山葡萄種質的抗寒性強 弱了解不足，影響了抗寒性種質資源的開發與利用。
[0005] 現有的鑒定葡萄屬抗寒性強弱最常用的方法是電導法，然而，我們在實際測定中 發現由于溫度、浸泡時間W及空氣中0)2的溶解等因素都會對實際測定的電導值產生影響， 造成測定結果重復性較差，鑒定結果不準確。
[0006] 有鑒于此，特提出本發明。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種山葡萄種質資源休眠期抗寒性的鑒定方法。針對目前 電導法測定葡萄屬抗寒性時由于溫度、浸泡時間W及空氣中0)2的溶解等因素導致測定結 果重復性較差，鑒定結果不準確的問題，本發明采用TTC染色法來鑒定山葡萄種質資源休 眠期的抗寒性。由于TTC染色法是通過將冷凍處理后的山葡萄枝條放入氯代Ξ苯基四氮挫 染色液中進行染色處理后觀察枝條木質部染色情況即可，在測定過程中受外界因素影響較 小，因此，采用該方法測定山葡萄種質資源休眠期抗寒性簡便易行，準確可靠。
[0008] 為了實現本發明的上述目的，特采用W下技術方案：
[0009] 一種山葡萄種質資源休眠期抗寒性的鑒定方法，包括如下步驟：
[0010] (1)將休眠期的山葡萄枝條在不同冷凍溫度下冷凍處理后剝去表皮，放入氯代Ξ 苯基四氮挫染色液中，置于恒溫環境中進行染色處理.
[0011] (2)沖去山葡萄枝條表面的染色液，根據山葡萄枝條木質部的染色面積確定染色 級別，并根據染色級別計算出山葡萄枝條的染色指數；
[0012] (3)根據山葡萄枝條的冷凍溫度所對應的染色指數確定低溫半致死溫度。
[0013] 氯代Ξ苯基四氮挫（即TTC)是一種顯色劑，能夠被具有活性的細胞中的酶系統所 還原，形成紅色不溶于水的Ξ苯基甲贈（TTF)。本發明采用TTC染色法來鑒定山葡萄種質資 源休眠期的抗寒性，將冷凍處理后的山葡萄枝條在不同的冷凍溫度下進行冷凍處理后剝去 表皮，放入TTC染色液中進行染色。
[0014] 染色后山葡萄枝條木質部的紅色面積越大，則在該冷凍溫度下山葡萄枝條的染色 級別越高，染色指數越大。通過計算不同冷凍溫度所對應的染色指數后確定該山葡萄種質 的低溫半致死溫度LTs。用W衡量山葡萄種質的抗寒性。LT5。越小，表明該山葡萄種質的抗 寒性越好。
[0015] 由于采用TTC染色法在測定過程中受外界因素影響較小，且結果直觀，因此，采用 該方法鑒定山葡萄種質資源休眠期抗寒性簡便易行，準確可靠。
[0016] 優選地，步驟（2)中，所述根據山葡萄枝條木質部的染色情況確定染色級別的步 驟具體包括：
[0017] 將山葡萄枝條縱切后，根據山葡萄枝條縱切面木質部的染色面積確定染色級別。
[0018] 目前，關于TTC染色法測定枝條組織活力研究中，均是通過觀察枝條橫截面剪口 木質部著色深淺程度來進行判定。實際操作中，染色生成的紅色TTF經常在枝條橫截面剪 口外側堆積，造成木質部染色過深產生觀測誤差；而采用徒手切片法切取枝條橫切面薄片 很難操作；木質部著色深淺程度目測也難W準確判斷。本發明中，改進了TTC染色法，染色 觀察部位改為枝條縱切面的木質部，用鋒利刀片縱向即可切開，操作簡便。
[0019] 同時，縱切面木質部基本呈規則矩形，有利于染色面積估測，使得染色分級界限清 楚可循，W克服傳統方法的不足，結果更加準確可靠。
[0020] 為了便于染色，提高染色效果，優選地，步驟（1)中，所述在不同冷凍溫度下冷凍 處理后剝去表皮之后，放入氯代Ξ苯基四氮挫染色液中之前還包括如下步驟： 陽021] 將剝去表皮的山葡萄枝條剪成0. 3~0. 5cm的枝條段。
[0022] 為了保證結果的準確性，進一步優選地，所述氯代Ξ苯基四氮挫染色液中枝條段 的數目為10~15個。
[0023] 同樣地，為了便于染色，提高染色效果，進一步優選地，步驟（1)中，所述染色處理 的溫度為28~32°C，染色時間18~2地，且在避光條件下進行。
[0024] 優選地，步驟（1)中，所述氯代Ξ苯基四氮挫染色液的濃度為0. 5~1. 0%。
[00巧]所用的氯代Ξ苯基四氮挫染色液的配置方法為：稱取0. 5~1.Og的氯化Ξ苯基四 氮挫，用去離子水溶解并定容于lOOmL容量瓶中，配好后避光、室溫保存。
[00%] 不同作物組織中的脫氨酶含量不同，活性不同，因而需要的染色條件也不同。本發 明中，篩選了適宜的TTC染色條件，包括染色枝段長度、染色液濃度、染色溫度、染色時間， 運些參數協同作用，共同提高了染色效果。
[0027] 優選地，步驟（1)中，所述在不同冷凍溫度下冷凍處理的步驟具體包括：
[0028] 將休眠期的山葡萄枝條置于-20~-50°C下冷凍12~15h，后將溫度升高至20~ 30°C，并在運一溫度下保持4-化。
[0029] 優選地，所述每組在不同冷凍溫度下冷凍處理的步驟具體包括：
[0030] 按照4~5°CA的降溫速度將山葡萄枝條所處環境的溫度降至設定溫度，在運一 溫度下保持12~13h，后逐漸升溫至20~30°C，在運一溫度下保持4~化。
[0031] 通過上述冷凍處理后的山葡萄枝條，用W進行抗寒性鑒定時，其結果更加準確。
[0032] 優選地，步驟似中，所述染色級別的確定方法為：
[003引當木質部縱切面有85%W上的面積呈紅色，則所述染色級別為4級；當木質部縱 切面有46 %~85 %的面積呈紅色，則所述染色級別為3級；當木質部縱切面有20 %~45 % 的面積呈紅色，則所述染色級別為2級；當木質部縱切面有20%W下的面積呈紅色，則所述 染色級別為1級。
[0034] 進一步優選地，步驟（2)中，所述染色指數=Σ(染色級別X枝段數）/(枝段總 數X最高染色級別）。
[0035] 通過上述方法確定的染色指數能夠更加真實地反映不同山葡萄品種的抗寒性，可 用于區分不同山葡萄品種之間的抗寒性。
[0036] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0037] (1)針對目前電導法測定葡萄屬抗寒性時由于溫度、浸泡時間化及空氣中C〇2的溶 解等因素導致測定結果重復性較差，鑒定結果不準確的問題，本發明采用氯代Ξ苯基四氮 挫染色法來鑒定山葡萄種質資源休眠期的抗寒性。由于TTC染色法是通過將冷凍處理后的 山葡萄枝條放入氯代Ξ苯基四氮挫染色液中進行染色處理后觀察枝條木質部染色情況即 可，在測定過程中受外界因素影響較小，因此，