專利名稱：一種新型蛋白質手性固定相的制備方法
一種新型蛋白質手性固定相的制備方法
技術領域：
本發明涉及手性液相色譜固定相技術領域，具體地說，是一種新型蛋白質手性固定相的制備方法。
背景技術：
手性化合物是指分子量、分子結構相同，但左右排列相反的一對分子，其物理化學性質幾乎完全相同，但它們的生化和藥理作用可能存在極大差異。例如具有鎮靜作用的反應停(thalidomide，酞胺哌啶酮)，其有效成分是R構型，而S構型則具有致畸作用。近年來，隨著生物科學和生物工程的發展，手性拆分已經成為了人們關注的焦點。目前用于手性分離的方法主要有薄層色譜法、毛細管電泳法、亞臨界及超臨界流體色譜法、氣相色譜法和液相色譜法等。高效液相色譜法以其高效的分離能力，已成為手性拆分強有力的手段之一。液相色譜手性拆分一般需使用特殊色譜固定，即手性固定相(CSP)，其性能決定了手性拆分的能力。CSP由采用一種手性物質化學鍵合或涂漬在固定相擔體上制成。可用于液相色譜手性拆分的手性固定相種類繁多，最常見的有多糖類、蛋白質和環糊精等類手性固定相。蛋白質手性固定相手性選擇性高，分離能力強，色譜峰形好。通常可以在反相模式下完成分離，通過色譜操作參數的調整，如緩沖液的組成、離子強度、PH值、有機改性劑和柱溫等，優化分離方法，因此其可拆分的化合物分布面廣。對于蛋白質鍵合方式，主要有吸附法和化學鍵合法。1973年，Mewart和Doherty將牛血清白蛋白(BsA)鍵合到瓊脂糖上并在其上成功地拆分了 D/L —色氨酸，20世紀80年代已出現了鍵合BSA和AGP的商品化硅膠HPLC填料。為提高CSI^s的柱容和穩定性，人們進行了許多嘗試，如用戊二醛將蛋白質交鏈，用蛋白質片段或結構域制備CSI^s，改變載體骨架等。由于蛋白質分子本身具有較大體積，無論采取何種鍵合固化方式，得到的CSP固載量均較低。這也使得它們在孔徑有限的填料上存在非常少的手性識別部位，柱容量較低。

發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種新型蛋白質手性固定相的制備方法，通過在大孔固定相基質外表面和孔內表面同時鍵合蛋白質分子，提高柱容量。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一、硅膠基質1、硅膠的預處理(1)堿化將孔徑大小為30 200nm的大孔硅膠置于稀堿溶液中堿化，然后用水洗至中性， 使-Si-OH充分活化。(2)硅烷化改性將堿化后的大孔硅膠與3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在一定溶劑條件(APTES MeOH H20 = 2 1 7)下，機械攪拌反應M小時，將氨基充分鍵合到大孔硅膠上。2、蛋白質鍵合在上述預處理完畢的大孔硅膠中加入濃度為15%戊二醛溶液，將之完全覆蓋，反應12小時，使硅膠上-NH2充分被C = O代替，將硅烷化改性后的大孔硅膠醛化，并用二次蒸餾水洗滌至中性；然后將溶于磷酸鹽緩沖液OOml，pH = 7. 4)的蛋白質與醛化后大孔硅膠混合，機械振蕩反應12 M小時，用二次蒸餾水多次洗滌，即可得到硅膠基質的新型蛋白質手性固定相，于4°C環境下0.02%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖溶液(50mmol/L，PH = 7)中保存。二、聚酰胺類高聚物基質1、醛化將聚酰胺溶于乙醇與異丙醇的混合溶液中，加入15%戊二醛溶液，室溫攪拌反應 12小時后，用水洗滌至中性。2、蛋白質鍵合將溶于磷酸鹽緩沖液QOml，pH = 7. 4)的蛋白質與改性后的聚酰胺基質混合，機械振蕩反應12h以上，用二次蒸餾水多次洗滌，即可得到聚合物基質的新型蛋白質手性固定相。本發明所述新型蛋白手性固定相制備方法在大孔固定相基質外表面和孔內表面同時鍵合蛋白質分子，小分子手性樣品可以充分利用鍵合后的大孔內徑通路，與孔內表面修飾的蛋白質分子作用。使用的基質可以為大孔硅膠和大孔聚酰胺類高聚物，還可以為大孔氨基鍵合硅膠及帶氨基活性基團的其它大孔聚合物。不僅可以在基質上鍵合某一種蛋白，還可以根據需要在基質上同時鍵合多種蛋白。與現有蛋白質手性固定相制備方法相比，本發明的積極效果是(1)本發明充分利用了大孔基質的大孔內徑，在大孔固定相基質外表面和孔內表面同時鍵合蛋白質分子，極大地提高柱容量，有效改善分離。(2)普適性高，基質可以為大孔硅膠、氨基鍵合硅膠、聚酰胺類高聚物和其它帶氨基活性基團的大孔聚合物；可在基質上鍵合一種或多種蛋白質。(3)操作簡單，使用范圍廣，制備的手性固定相可以用于液相色譜分離分析、毛細管電色譜分析以及制備液相色譜手性分離。

圖1為實施例1中所得大孔硅膠鍵合蛋白質手性固定相示意2為實施例2中所得大孔聚酰胺鍵合蛋白質手性固定相示意3為實施例1中氨基酸對映體分離色譜圖
具體實施方式以下提供本發明一種新型的蛋白質手性固定相的制備方法的具體實施方式
。實施例1稱取5. Og粒徑為5 μ m的大孔硅膠，內孔直徑100納米，置于0. lmol/L稀堿溶液中，機械攪拌反應半小時，然后用水洗至中性；稱取APTES = 6ml,H20 = 3ml,MeOH = 21ml, 將三種溶液混合后，與上述大孔硅膠加入混合，機械攪拌反應M小時，再用二次蒸餾水洗滌至中性；加入15%戊二醛溶液反應12小時，使其-NH2充分被C = O代替，并用二次蒸餾水洗滌至中性；將溶于磷酸鹽緩沖液的糖蛋白質置于醛化后的大孔硅膠中，機械振蕩反應 12小時，用二次蒸餾水多次洗滌，放置于4°C環境下疊氮鈉的磷酸鹽緩沖溶液中保存。將上面得到的糖蛋白手性固定相填充規格為4. 6X200mm的HPLC分析柱，在流動相為20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH = 4. 5)，流速lmL/min，室溫下分離谷氨酸對應異構體。結果如圖3所示，谷氨酸對應異構體得到良好分離。實施例2將聚酰胺溶于乙醇與異丙醇的混合溶液中，待完全溶解后，加入15%戊二醛溶液， 室溫攪拌反應12小時后，用水洗滌至中性，真空烘干。得到的基質內孔直徑70納米。將溶于磷酸鹽緩沖液QOml，pH = 7. 4)的蛋白質置于改性后的聚酰胺基質中，機械振蕩使其充分反應，用二次蒸餾水多次洗滌，最后將所得產物緩慢倒入正己烷中，析出沉淀，過濾，干燥。以上所述是本發明的兩種使用方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干該進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種新型蛋白質手性固定相的制備方法，其特征在于在大孔固定相基質外表面和孔內表面同時鍵合蛋白質分子制備成液相色譜手性固定相，小分子手性樣品可以充分利用鍵合后的內孔通路，與孔內表面修飾的蛋白質分子作用，極大地提高柱容量，有效改善分 1 ；
2.如權利要求1所述的新型蛋白質手性固定相的制備方法，其特征在于所述的大孔基質材料包括硅膠及聚酰胺類等高聚物；
3.如權利要求1所述的新型蛋白質手性固定相的制備方法，其特征在于大孔顆粒基質的外徑為5-50微米，內孔的直徑為30-200納米；
4.如權利要求1所述的新型蛋白質手性固定相的制備方法，其特征在于用于固定相表面改性的蛋白質包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、α 1-酸性白蛋白、卵類白蛋白、纖維二糖水解酶及其它蛋白；
5.如權利要求1所述的新型蛋白質手性固定相，其特征在于可以用于液相色譜分離分析、毛細管電色譜分析以及制備液相色譜手性分離。
全文摘要
本發明涉及一種新型蛋白質手性固定相的制備方法。在大孔固定相基質外表面和孔內表面同時鍵合蛋白質分子制備成液相色譜手性固定相，小分子手性樣品可以充分利用鍵合后的內孔通路，與孔內表面修飾的蛋白質分子作用，極大地提高柱容量，有效改善分離。基質可以為硅膠或高聚物，作為手性選擇器的蛋白質可以根據分離選擇性的不同加以調節。本發明的優點在于制作方法簡單，分離效率高。
文檔編號B01J20/29GK102553549SQ20111032785
公開日2012年7月11日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者喬月, 張凌怡, 張維冰, 鄭翌, 黃蘭淇 申請人:華東理工大學