專利名稱：一種敲除牛mstn基因的打靶載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學及生物技術領域，涉及一種啟動子捕獲型打靶載體，具體地，涉及一種敲除牛MSTN基因的啟動子捕獲型打靶載體及其應用。
背景技術：
肌肉生長抑制素(MSTN)是特異性骨骼肌生長發育負調控因子，其活性的喪失或降低，會引起動物肌肉的過度發育，牛MSTN基因的自然突變會引發“雙肌”現象。雙肌牛比正常牛具有較高的瘦肉率和較好的肉質，且脂肪率低，口感良好，但國內現有品種中缺少“雙肌”表型的牛。通過基因敲除技術構建了 MSTN基因突變純合體小鼠，發現并驗證了生長抑素基因突變鼠的體重比正常鼠大30%，而且這種差異在成年鼠中不受年齡和性別的影響(McPherron A C, 1997, Nature 387,83-90)。以雙肌現象著稱的比利時藍牛(BelgianBlue)和皮德蒙特牛(piedmontese)就是MSTN基因發生自然突變。比利時藍牛MSTN基因序列中的第3個外顯子上缺失了 11個核苷酸，是導致MSTN基因閱讀框發生移位，使MSTN被截短，不能發揮其生物的活性；皮爾蒙特牛則是由于第3個外顯子發生了錯誤突變，導致了在成熟蛋白區內酪氨酸代替了保守的半胱氨酸，而在第I個外顯子也發生了突變，造苯丙氨酸代替了亮氨酸，起結果均使肌肉生成抑制素的功能全部或者幾乎全部喪失(KambadurR，1997，Genome Res 7 (9),910-916) MSTN基因的發現，為生物育種工作者提供了新的思路。但是，育種工作者利用現有的雙肌動物進行繁育存在育種速度慢和雜交性狀不穩定等問題。2000年，McCreath等利用體外培養的綿羊胎兒成纖維細胞進行COLlAl基因的定點突變，并利用定點突變成功的細胞作為體細胞克隆的核供體，已經成功獲得基因定點修飾的活的小羊，這為家畜類動物的基因修飾提供了有效的途徑(McCreath，2000，Nature 405，1066-1069)。另外，研究表明，在體細胞中進行基因打靶，啟動子捕獲型打靶載體的效率比傳統的有啟動子打靶載體聯合正負篩選策略的效率高出 100 倍左右(ffaldman A S，1992，Crit Rev Oncol Hematol 22(1)，127-128)。目前，在家畜MSTN基因敲除研究方面，國內外在載體構建方面做了大量的研究工作，獲得了一些MSTN基因敲除細胞系。但動物出生的報道相對較少，其中利用啟動子捕獲型載體進行MSTN基因突變的就更加罕見。

發明內容
本發明的目的在于提供一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動子捕獲型打靶載體；本發明的另一個目的在于提供該啟動子捕獲型打靶載體的應用。為達到上述目的，本發明的技術方案是從和牛耳部組織中提取牛的基因組DNA，根據Genebank報道的牛MSTN基因序列設計長短同源臂引物，通過PCR方法從基因組DNA中克隆同源臂，將同源臂分別克隆到表達載體，經過限制性內切酶酶切和測序分析確定同源臂的準確性后，采用酶切和連接的方法將長短同源臂分別連接到基礎載體PIII中，最后通過限制性內切酶酶切鑒定同源臂連接的正確性，構建獲得一種敲除牛MSTN基因的啟動子捕獲型打靶載體PII1-MSTN(構建過程參見圖1)。MSTN基因的核苷酸序列在進化過程中高度保守，包括3個外顯子和2個內含子，其中第三個外顯子是它的成熟區；牛的MSTN基因位于2號染色體的近著絲粒端距離TGLA44(微衛星標記，ms) 3.1cM的位置，包括6691個堿基，3個外顯子分別位于10134 10506、12335 12708和14741 15121位置上。基礎載體PIII包含一個不含啟動子的綠色熒光蛋白EGFP基因和一個含自身啟動子PGK的新霉素抗性基因(Neolr)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本發明提供的啟動子捕獲型打靶載體為PII1-MSTN，包含MSTN基因長短同源臂3’同源臂和5’同源臂，PII1-MSTN載體中的MSTN基因同源臂序列能夠靶向性界定并敲除基因組上的靶基因。所述的5’同源臂不包含MSTN基因自身啟動子的全部序列，且最后一個堿基為MSTN第一外顯子起始密碼子上游最后一個堿基。所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 的 15091 21957。打靶載體PII1-MSTN可敲除牛MSTN基因第一、二外顯子的全部和第三外顯子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；PII1-MSTN核苷酸序列如SEQ ID N0:3，包含長約1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、無啟動子的綠色熒光蛋白基因EGFP和自身帶有啟動子PGK的新霉素抗性基因Neolr表達框架。當打靶載體與靶基因序列發生同源重組時，通過表達標記基因，從而確定PII1-MSTN載體中的MSTN基因同源臂序列靶向性界定并敲除基因組上的靶基因。本發明用于擴增上述MSTN基因同源臂的引物，分別包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的兩組PCR引物對。本發明提供了用 PCR方法擴增牛MSTN基因同源臂的具體引物:5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC,5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ；3’ 同源臂上游引物:GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT,3’同源臂下游引物:AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA,下劃線部分為酶切位點。本發明提供一種構建敲除MSTN基因啟動子捕獲型打靶載體的方法，包括如下步驟:I)提取牛組織基因組DNA ；2)利用上述引物用PCR方法從步驟I)的基因組DNA中克隆MSTN基因的長短同源臂，分別為3’同源臂和5’同源臂；3)將同源臂克隆到表達載體經限制性內切酶和測序分析進行鑒定；4)將鑒定正確的同源臂連接到基礎載體PIII中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，構建得到敲除牛MSTN基因的打靶載體。其中步驟2)所述的PCR方法擴增5’同源臂，其反應條件為:95°C變性50s，60°C復性50s，72°C延伸2min，共35個循環；所述的PCR方法擴增3’同源臂，其反應條件為:95°C變性50s，59。。復性50s，72。。延伸7min，共35個循環。
G418 (Geneticin selective antibiotic 418)是一種抗生素類藥物，當 Neor 基因被整合進真核細胞DNA后，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。G418的這一選擇特性，已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛應用。本發明還提供一種敲除牛MSTN基因的方法，利用電轉染的方法將打靶載體導入牛胎兒(50天胎齡)成纖維細胞中，根據置換型打靶載體的原理，如圖2中打靶載體PII1-MSTN的同源臂序列N5mstn和N3mstn分別與野生型MSTN基因發生交換，獲得中靶后MSTN基因序列，即MSTN基因的第一外顯子和第二外顯子的全部以及第三外顯子的大部分被從基因組內置換掉，而取代它的是綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因。發生正確敲除的中靶后細胞將喪失轉錄表達肌肉生長抑制素的功能，而表現出綠色熒光和新霉素抗性。這時利用G418篩選將不帶有新霉素抗性的細胞殺死，從帶有新霉素抗性的細胞克隆中挑選表達綠色熒光蛋白的陽性克隆。再利用PCR檢測和DNA測序的方法對陽性克隆進行鑒定，確定哪些克隆是真正成功敲除MSTN基因的。本發明提供了啟動子捕獲型打靶載體PII1-MSTN在培育肉用牛品種中的應用。啟動子捕獲通常采用IRES序列引導篩選標記基因的表達，而本發明用來捕獲內源MSTN基因啟動子的綠色熒光蛋白基因的上游沒有連接IRES序列，綠色熒光蛋白的起始密碼子ATG正好落在MSTN基 因原來的起始密碼子上。本發明將同源左臂設計成一個長約
1.3kb的片段，這樣的長度既有利于同源重組的發生，也沒有完全包含MSTN啟動子區域，不影響綠色熒光蛋白捕獲啟動子作用的發揮。另外，本發明提供的啟動子捕獲型打靶載體PII1-MSTN，能夠準確地敲除MSTN基因的第一、二外顯子的全部和第三外顯子的大部分，可以達到使MSTN基因發生失活的目的；且中靶細胞既具有一定的G418藥物抗性，又表達綠色熒光蛋白，只有同時具備這兩種特性的細胞克隆才會被用于進一步同源重組鑒定，大大簡化同源重組細胞克隆的篩選工作。本發明提供的啟動子捕獲型打靶載體pii1-mstn可以用來培育敲除了 MSTN基因的轉基因肉用牛。


圖1是啟動子捕獲型打靶載體PII1-MSTN的構建過程圖；圖2是載體PII1-MSTN打靶過程示意圖；圖3是和牛耳組織基因組DNA電泳結果，其中1:DNA marker λ -HindIII ；2:和牛耳部組織基因組DNA;圖4是PCR擴增的牛MSTN基因5’同源臂的電泳圖譜，I:分子量標準(IkbLadder) ；2:PCR擴增的牛MSTN基因5，同源臂，其PCR產物為1327bp ；圖5是PCR擴增的牛MSTN基因3’同源臂的電泳圖譜，1:分子量標準(DNAmarker λ -EcoT14I) ；2:PCR擴增的牛MSTN基因3，同源臂，其PCR產物為6885bp ；圖6是利用限制性內切酶對PII1-N5mstn質粒進行酶切鑒定的電泳圖譜，a:分子量標準(DNA marker λ -EcoT14I), b:分子量標準(IOObpDNALadder), I:PII1-N5mstn 質粒；2 4:用限制性內切酶Hindlll、BglII和Sac II分別酶切鑒定PII1-N5mstn質粒，HindIII酶切產物為5640bp和1315bp,BglII酶切產物為6542bp和413bp，Sac II酶切產物為 6955bp ；
圖7是利用限制性內切酶對PII1-MSTN質粒進行酶切鑒定的電泳圖譜，a:分子量標準(DNA marker λ -Hindi 11), b:分子量標準(IOObp DNALadder), 1:PIII_MSTN 質粒；2 6:用限制性內切酶EcoR 1、Sac I1、HindI1、BglII和Cla I分別酶切鑒定PII1-MSTN質粒，EcoR I酶切產物為13828bp，Sac II酶切產物為6955bp和6873bp,HindII酶切產物為 8245bp 和 5683bp, BglII 酶切產物為 5789bp、3958bp、3668bp 和 413bp, Cla I 酶切產物為 13828bp。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1牛耳組織基因組DNA的提取稱取500mg保存于_80°C超低溫冰箱的和牛(來自于內蒙古自治區四子王旗牧場)的耳部組織，用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification Kit試劑盒，按鼠尾組織DNA提取方法，進行和牛耳部組織基因組DNA的提取，最后采用100 μ L無菌蒸餾水回溶DNA。用紫外分光光度計檢測提取的DNA的濃度和340nm波長下的OD值，并取I μ L進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA完整性。電泳結果顯示提取到完整的和牛基因組DNA，見圖3。實施例2MSTN 基因同源臂 pMD19-T_N5mstn 和 pMD19-T_N3mstn 的獲得根據模板序列G enBank Accession N0.NC_007300,分別設計啟動子捕獲型打革巴載體的MSTN基因5’同源臂(位于SEQ ID NO:1的8834 10133)的上、下游引物ShortA(TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC)和 ShortB (TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT)，及3’同源臂(位于SEQ ID NO:1的15091 21957)的上、下游引物LongA(GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT)和 LongB (AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA)，下劃線部分為酶切位點。以上述牛耳組織基因組DNA為模板，分別進行PCR合成啟動子捕獲型打靶載體的MSTN基因的5’和3’同源臂。PCR反應均為20 μ L反應體系:上下游引物各2 μ L，模板DNA0.5 μ L，10 X Buffer2 μ L, 25mM MgCl2L 4 μ L, 2.5mM dNTPs3 μ L, EXTaq0.2 μ L,滅菌 ddH20 8.9 μ L。5’同源臂的PCR反應條件:95°C變性50s，60°C復性50s，72°C延伸2min，共35個循環。3’同源臂的PCR反應條件:95°C變性50s，59°C復性50s，72°C延伸7min，共35個循環。分別將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(參見圖4和5)后，利用大連寶生物公司的DNA凝膠回收試劑盒回收獲得MSTN基因5’同源臂和3’同源臂，并將它們連接到PMD19-T Simple (購自大連寶生物公司)載體上，連接產物分別轉化大腸桿菌DH5 α，分別挑取連接陽性菌落進行菌體擴培和質粒提取，獲得MSTN基因同源臂pMD19-T-N5mstn和pMD19-T-N3mstn 兩種質粒。實施例3 5’同源臂pMD19-T-N5mstn的酶切鑒定及測序分析取IyL 5’同源臂pMD19-T-N5mstn質粒，分別利用限制性內切酶HindIII和BglII進行酶切鑒定，它們的酶切位點分別位于5’同源臂的兩端和內部，可初步檢測PCR獲得的5’同源臂的正確性。酶切體系均為IOyL:5’同源臂pMD19-T-N5mstn質粒lyL，10\81^€61'14 1^，內切酶0.5 4 1^，滅菌(1(1!120 7.5 μ L0將酶切鑒定正確的質粒進行DNA測序分析，結果表明5’同源臂與GenBank報道的牛MSTN基因序列的同源性為96%。實施例43’同源臂pMD19-T-N3mstn的酶切鑒定及測序分析取IyL 3’同源臂pMD19-T_N3mstn質粒，分別利用限制性內切酶Sac II和HindIII進行酶切鑒定，它們的酶切位點分別位于3’同源臂的兩端和內部，可初步檢測PCR獲得的3’同源臂的正確性。酶切體系同實例3。將酶切鑒定正確的質粒進行DNA測序分析，結果表明3’同源臂與GenBank報道的牛MSTN基因序列的同源性為97%。實施例55’同源臂連入基礎載體PIII將測序正確的克隆的質粒pMD19-T-N5mstn與基礎載體PIII同時用HindIII酶切，酶切體系同前，分別回收1315bp的5’同源臂和5640bp的骨架載體片段，按照摩爾比2:1的比例16°C經T4DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5a，提取質粒(命名為PII1-N5mstn)。利用限制性內切酶HindII1、Bgl II和Sac II酶切鑒定連接的方向和正確性(參見圖6)，結果表明5’同源臂序列正確插入基礎載體PIII中。實施例6 3’同源臂連入基礎載體PIII將測序正確的克隆的質粒pMD19-T_N3mstn與質粒PII1-N5mstn同時用Sac II酶切，酶切體系同前，分別回收6873bp的3’同源臂和6955bp的線性PII1-N5mstn片段，按照摩爾比2: I的比例16°C經T4DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5a，提取質粒。利用限制性內切酶EcoRI，Sac II，HindII，Bgl II和Cla I酶切鑒定連接的方向和正確性，參見圖7，結果表明3’同源臂序列正確插入基礎載體PIII中，成功獲得用于牛MSTN基因敲除的啟動子捕獲型打靶載體PII1-M STN。 實施例7載體PII1-MSTN的打靶實例用限制性內切酶Cla I于30°C酶切打靶載體PII1-MSTN質粒4_6h線性化質粒PII1-MSTN后，取牛胎兒成纖維細胞和線性化的質粒PII1-MSTN混勻，電擊轉染細胞(轉染條件:細胞密度為I X IOVmL,體積400 μ 1，質粒含量20 μ g，4mm電擊杯中，500V電壓、4ms電脈沖時間，電脈沖次數I次)，轉染后的細胞以密度3X 105/100mm培養。轉染后的第48小時加入G418進行抗藥性篩選，篩選7-10天后，顯微鏡下察看細胞克隆，并用自制的克隆杯和胰蛋白酶消化并用移液器吸取100個細胞以上克隆，且在熒光顯微鏡下分選出綠熒光細胞克隆和非綠熒光細胞克隆。將綠色熒光細胞單克隆擴大培養后，一部分冷凍保存，一部分提取基因組等待鑒定。以基因組染色體定點整合序列為模板，設計跨越5’同源臂序列的PCR引物，利用PCR法和DNA測序檢測同源重組事件。PCR方法所用引物為:Pa:5/ -CGATGCCTGCTTGCCGAATATCATG-3'(位于 pPLP-MSTN載體內 Neo 基因上)和Pb:5/ -TCCTGGTGTCTCATTTCCTCAGAGC-3'(位于 pPLP-MSTN 載體的 3’ 同源臂外側);反應條件:95°C50s, 63°C 50s，72°C 7min，35 個循環；通過 PCR 法擴增出 2.4kb 的片段，并進行DNA測序確定序列的準確性。
當檢測到的序列同時包含MSTN基因5’同源臂上游部分序列、5’同源臂全部序列和egfp基因部分序列時，認為該細胞已發生MSTN基因敲除。將MSTN基因敲除的細胞作為體細胞核移植的供體，進行牛體細胞克隆實驗及胚胎移植實驗，即可通過受體母牛的妊娠和分娩產下MSTN基因敲除的犢牛。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范 圍。
權利要求
1.一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動子捕獲型打靶載體。
2.按權利要求1所述的打靶載體，其包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一個堿基為MSTN第一外顯子起始密碼子上游最后一個堿基，在同源臂之間還具有標記基因。
3.按權利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述5’同源臂核苷酸序列如SEQIDNO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO:1的15091 21957。
4.按權利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述標記基因包括報告基因EGFP和帶有啟動子PGK的新霉素抗性選擇基因Nec/。
5.按權利要求1 4之一所述的打靶載體，其為PII1-MSTN，質粒圖譜如圖1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3o
6.一種擴增權利要求1 5之一所述的打靶載體中MSTN基因同源臂的引物，其分別包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的兩組PCR引物對。
7.按權利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物為: 5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC, 5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ； 3 ’ 同源臂上游引物:GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT， 3’ 同源臂下游引物:AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA0
8.一種構建權利要求1 5之一所述打靶載體的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提取牛組織基因組DNA; 2)以權利要求6或7所述的引物用PCR方法從步驟I)的基因組DNA中克隆MSTN基因的長短同源臂，分別為3’同源臂和5’同源臂； 3)將同源臂克隆到表達載體經限制性內切酶和測序分析進行鑒定； 4)將鑒定正確的同源臂連接到基礎載體PIII中，該基礎載體核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，構建得到敲除牛MSTN基因的打靶載體。
9.按權利要求8所述的方法，其中步驟2)所述的PCR方法擴增5’同源臂，其反應條件為:95°C變性50s，60°C復性50s，72°C延伸2min，共35個循環；所述的PCR方法擴增3’同源臂，其反應條件為:95°C變性50s，59°C復性50s，72°C延伸7min，共35個循環。
10.一種敲除牛MSTN基因的方法，其特征在于，利用電轉染的方法將權利要求1 5之一所述的打靶載體導入胎兒成纖維細胞中，通過同源臂的置換，達到敲除MSTN基因的目的。
11.按權利要求1 5之一所述的打靶載體在培育肉用牛品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動子捕獲型打靶載體PIII-MSTN，其可敲除牛MSTN基因第一、二外顯子的全部和第三外顯子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；PIII-MSTN核苷酸序列如SEQ ID NO3，包含長約1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、無啟動子的綠色熒光蛋白基因EGFP和自身帶有啟動子PGK的新霉素抗性基因Neor表達框架。本發明的啟動子捕獲型打靶載體PIII-MSTN可用于培育敲除了MSTN基因的轉基因肉用牛。
文檔編號C12N15/09GK103088044SQ20111034221
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者李榮鳳, 趙麗華, 李雪玲, 梁浩, 云亭 申請人:內蒙古大學